[發(fā)明專利]一種推斷寡核苷酸在基因組上結(jié)合位點(diǎn)的方法和系統(tǒng)

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410568387.0
• 申請日: 2014-10-22
• 公開（公告）號: CN105590038A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張成崗;屈武斌;劉哲言
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所;北京云醫(yī)國際科技有限公司
• 主分類號: G06F19/18
• 分類號: G06F19/18;G06F17/30
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11205
• 代理人: 劉芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種推斷寡核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的方法和系統(tǒng)，尤其涉及一種推斷寡核苷酸在基因組上結(jié)合位點(diǎn)的方法和系統(tǒng)。

背景技術(shù)

寡核苷酸(oligonucleotide或oligo)是一類短鏈核苷酸的總稱，通過與其互補(bǔ)序列匹配，常作為探針以確定目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)，或作為引物來有效擴(kuò)增模板序列。目前基于寡核苷酸雜交的分子生物技術(shù)(如芯片探針、PCR引物等)在二代測序、病原微生物檢測、芯片雜交、臨床診斷等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用并發(fā)揮重要作用。其根本原理是核酸分子雜交，即互補(bǔ)的核苷酸序列在一定條件下(適宜的溫度及離子強(qiáng)度等)通過Watson-Crick堿基配對形成非共價(jià)鍵，從而形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子的過程。

由于這些分子生物學(xué)技術(shù)的穩(wěn)定性與敏感性強(qiáng)烈依賴于設(shè)計(jì)出的寡核苷酸(在芯片中對應(yīng)探針，在PCR中對應(yīng)引物)的質(zhì)量，即設(shè)計(jì)出寡核苷酸自身需要具有高穩(wěn)定性，同時(shí)能與目標(biāo)序列的目標(biāo)區(qū)域高特異性結(jié)合，而與其它區(qū)域不結(jié)合。如果設(shè)計(jì)不佳，以PCR為例，非特異的引物會(huì)觸發(fā)非特異擴(kuò)增，進(jìn)而導(dǎo)致假陽性的檢測結(jié)果。所以設(shè)計(jì)合適的寡核苷酸探針以及PCR引物至關(guān)重要，而通過預(yù)測設(shè)計(jì)的寡核苷酸在目標(biāo)序列上結(jié)合位點(diǎn)，是一種有效的判斷該寡核苷酸是否適用于該目標(biāo)序列的方法。

當(dāng)前寡核苷酸設(shè)計(jì)軟件廣泛使用BLAST進(jìn)行序列相似性分析來對設(shè)計(jì)的寡核苷酸進(jìn)行質(zhì)量控制，BLAST是一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列相似性比較的局部比對分析工具，通過序列相似性打分來說明序列之間的相似程度。所謂序列相似性又名序列一致性，是序列相似程度的一種描述，值的大小取決于序列比對過程中檢測序列和目標(biāo)序列之間對應(yīng)位置上相同字符的個(gè)數(shù)，值越大，表示兩條序列越相似。由于BLAST具備較快的比對速度和較高的比對精度，因此在常規(guī)序列比對分析中應(yīng)用最為廣泛。例如目前流行的PCR引物設(shè)計(jì)軟件PerlPrimer，芯片探針設(shè)計(jì)軟件Mprobe、oligoarray以及siRNA設(shè)計(jì)軟件siRNATargetFinder等都使用了BLAST序列比對的思想。

然而，BLAST不能準(zhǔn)確反映寡核苷酸結(jié)合的真實(shí)情況。BLAST的打分體制是根據(jù)序列之間對應(yīng)位置上的堿基相同(如AA、TT等)或不相同(如AT、GC等)賦予不同的分?jǐn)?shù)，或者進(jìn)一步對不相同的堿基根據(jù)不同的匹配度(嘌呤與嘌呤之間或嘧啶與嘧啶之間的轉(zhuǎn)換如AG或者CT之間的匹配，嘌呤與嘧啶之間的顛換如AC、AT、GC、GT之間的匹配)給出不同的打分，從而以各部分匹配分?jǐn)?shù)的總和決定整體的相似程度，進(jìn)而衡量結(jié)合效果。而寡核苷酸雜交過程是一種生物化學(xué)反應(yīng)，分子之間相互作用并非是匹配了多少個(gè)堿基，而依賴于是否能夠在包含了溫度、鹽離子濃度、pH值等復(fù)雜的熱力學(xué)環(huán)境下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。因此寡核苷酸結(jié)合的本質(zhì)是一個(gè)熱力學(xué)的穩(wěn)定性過程而不是序列比對。因此，BLAST中對于AT、GC之間匹配賦予一致的打分就不能反應(yīng)GC之間由于三個(gè)氫鍵的連接穩(wěn)定性高于AT之間的兩個(gè)氫鍵的結(jié)合能力這一事實(shí)。并且某些錯(cuò)配結(jié)構(gòu)在熱力學(xué)結(jié)合能力上表現(xiàn)穩(wěn)定，而BLAST統(tǒng)一給予相同的罰分處理容易導(dǎo)致對這些結(jié)合位點(diǎn)喪失預(yù)測能力。

同時(shí)寡核苷酸雜交狀態(tài)會(huì)呈現(xiàn)多種模式，除了最穩(wěn)定的狀態(tài)完美匹配之外，在多數(shù)情況下，結(jié)合雙鏈中也會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、內(nèi)環(huán)、膨脹環(huán)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)。BLAST算法自身的局限性使得只能對其中的一部分結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，只允許序列中段少數(shù)幾個(gè)堿基的錯(cuò)配，致使相當(dāng)一部分結(jié)構(gòu)的丟失，而對于末端錯(cuò)配、loop、hairpin等復(fù)雜結(jié)構(gòu)束手無策。

最近鄰模型(Nearest-NeighborModel，簡稱NNmodel或最臨近法模型)是廣為流行和應(yīng)用的最可靠的熱力學(xué)計(jì)算方法，該模型指出一個(gè)給定的堿基對的穩(wěn)定性依賴于其臨近堿基對的穩(wěn)定性，其主要思想是將DNA分子雜交反應(yīng)過程的標(biāo)準(zhǔn)焓變和熵變計(jì)算轉(zhuǎn)化為由組成DNA分子的4個(gè)堿基A、T、G、C所形成的10個(gè)二聚體(duplex)的標(biāo)準(zhǔn)焓變和熵變的累加和。然而對設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列與其結(jié)合序列雜交的熱力學(xué)穩(wěn)定性的計(jì)算，現(xiàn)有技術(shù)中通常將該方法應(yīng)用于從前至后逐一堿基的計(jì)算，即遍歷的思路，運(yùn)算復(fù)雜，搜索過程緩慢且效率較低。

因此，需要一種高效的，能真正反映寡核苷酸結(jié)合熱力學(xué)性質(zhì)的方法和系統(tǒng)，來確定設(shè)計(jì)的寡核苷酸在目標(biāo)序列上的結(jié)合位點(diǎn)以及結(jié)合穩(wěn)定性，進(jìn)而判斷該寡核苷酸是否為針對該目標(biāo)序列的高質(zhì)量寡核苷酸。

發(fā)明內(nèi)容