[發明專利]一種生物合成葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的方法

有效

• 申請號: 201410564643.9
• 申請日: 2014-10-21
• 公開（公告）號: CN104312987B
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 康振;陳堅;堵國成;王淼;劉葉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N1/21;C12P19/02;C12P7/44;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙)11419
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種生物合成葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的方法，屬于代謝工程領域。

背景技術

葡萄糖醛酸，全稱D-(+)-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)，葡萄糖醛酸廣泛存在于動植物中，具有重要的生物學功能。它能結合含有羥基、氨基、羧基、巰基等基團的有毒物質，增強毒性物質水溶性，使之快速排出腎臟，起到解毒作用。同時，葡萄糖醛酸能與被結合物分子上活性基團-酚羥基結合，降低相關激素及藥物的生物學作用。其衍生物葡萄糖醛酸內酯是也是一種保健藥物，它有利于肝臟的解毒，可以預防治療流行性肝炎、肝硬化、食物及藥物中毒，同時還是功能性飲料、保健食品的添加劑。隨著人們健康觀念的日益增強和對生活質量要求的提高，對于葡萄糖醛酸的需求會越來越大。

葡萄糖二酸(glucuric acid，saccharic acid)又名葡萄糖質酸，是葡萄糖的醛基及C-6上羥基均被氧化成羧酸(如硝酸作用)而形成的糖酸。葡萄糖二酸及其衍生物在一些植物及哺乳動物中均有發現，特別是在一些十字花科蔬菜、草莓和柑橘類水果中含量豐富。葡萄糖二酸具有重要的生物功能，被美國能源部確定為“最有價值的生物煉制產品”。它可以降低膽固醇、用于癌癥的治療，同時其鈣鹽也是一種食品添加劑。葡萄糖二酸在水溶液中不穩定，易轉變為葡萄糖二酸內酯的形式，二者在水溶液處于互變平衡狀態。葡萄糖二酸1,4內酯也是一種重要的功能產品，它可使肝素、透明質酸、硫酸粘多糖以及葡萄糖醛酸的破壞大大減少，幫助身體有效的排除毒素，并能夠緩解關節炎、痛風、氣喘和相關組織功能下降所引起的其他不適。

目前，葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸的生產方法主要為化學氧化法，化學法生產存在諸多弊端，如生成的產物較多，副產物復雜，同時產生大量氣體，其反應廢液對環境產生污染等，通過生物法來制備葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸越來越受到研究者的關注。

葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸存在于哺乳動物的代謝途徑中，葡萄糖二酸與抗壞血酸是葡萄糖醛酸代謝途徑的終產物。然而，從D-葡萄糖或D-半乳糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反應。

目前，來源于畢赤酵母(Pichia pastoris)中的肌醇加氧酶基因(MIOX)鮮有報道。本發明通過重組大腸桿菌，表達來源于畢赤酵母(Pichia pastoris)中的肌醇加氧酶(MIOX)基因，實現了生物轉化肌醇，生成葡萄糖醛酸，同時，共表達來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脫氫酶基因(Udh)，實現了葡萄糖二酸的生成。

本發明中構建的重組工程菌實現了葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸的生物合成，為生物法探索生成目標代謝產物提供了新思路。

發明內容

本發明通過構建一株表達來源于畢赤酵母(Pichia pastoris)的肌醇加氧酶基因(MIOX)的重組大腸桿菌，實現了從肌醇到葡萄糖醛酸的轉化。同時，該重組大腸桿菌再表達來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脫氫酶基因(Udh)，能夠實現葡萄糖二酸的生物合成。

本發明的第一個目的是提供一種重組大腸桿菌A，是將氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列的肌醇加氧酶基因MIOX克隆至大腸桿菌中構建的重組菌。

所述肌醇加氧酶基因MIOX來源于畢赤酵母，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發明的第二個目的是提供一種重組大腸桿菌B，該重組大腸桿菌B同時表達了氨基酸如SEQ ID NO.1所示的肌醇加氧酶基因MIOX和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的醛酸脫氫酶基因Udh。

所述醛酸脫氫酶基因Udh來源于惡臭假單胞菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發明的第三個目的是提供一種重組大腸桿菌B的構建方法，是將肌醇加氧酶基因和醛酸脫氫酶基因與表達載體相連，構建重組質粒，轉化大腸桿菌宿主菌，即得到重組大腸桿菌B。

所述表達載體在本發明的一種實施方式中是pRSFDuet-1。