[發明專利]基于DNA Barcoding的9種常見魚類鑒別試劑盒

無效

• 申請號: 201410561562.3
• 申請日: 2014-10-22
• 公開（公告）號: CN104450883A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 趙生國;邊琳鶴;李永青;郭永博;鄭王山;權金強;汪文強;車攏杰
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明公開了一種魚類的鑒別方法，尤其涉及到一種基于DNA?Barcoding的9種常見魚類（多寶魚、青魚、中華鱘、金鯧、帶魚、生魚、黃河鯰、武昌魚、鱈魚）鑒別方法。

背景技術

魚類作為水生環境的指標生物，不僅可做為水體凈化指標，還可以作為外來物種入侵檢驗指標，同時魚類多樣性指標也可以反映其生境狀態。近年來，隨著我國經濟的高速發展，生態問題日益突出，為外來物種的入侵提供了便利條件，給當地魚類開發和保護帶來隱憂。如何快速有效的識別魚類成為迫切需要解決的問題。但是，由于傳統的形態分類學目前得不到足夠的重視，形態分類的專業人員逐步減少，影響了魚類資源保護以及生境研究等工作。

近年來廣泛發展的一種由四川大學研發出的魚類分子生物學快速鑒別方法CN200510022323.1，是通過編碼魚類RNA的核DNA序列的保守性及其轉錄間隔子的種間差異結合傳統的電泳技術鑒別魚類，這種方法耗時較長，成本較高，更關鍵的是這種方法無法用于篩選和鑒定特定的魚類。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明公開了一種9種常見魚類及其生肉制品的鑒別方法，通過對編輯好的堿基序列長度進行比較來鑒別多種魚類中是否有這9種魚類中的某種，該方法是基于DNA?Barcoding建立的，不受被鑒定材料的形態限制，即便是個體的組織碎片，也能得出準確的結論，因此可廣泛用于9種常見魚類及其生肉制品的準確鑒定。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

1、根據已知魚類的?DNA條形碼數據庫，設計和合成多組引物。

2、從包含這9種魚的多種魚類中提取DNA，利用引物對每個待測對象的DNA進行擴增，根據擴增的結果，選出最佳引物和反應條件。

3、利用步驟（2）篩選出的引物對每個待測對象的DNA進行擴增，擴增后的序列進行測序，然后進行數據分析，從而得到針對常見魚類?DNA?Barcoding?數據庫。

4、在建立DNA?Barcoding?數據庫后，對新的待測對象采用步驟（2）篩選出的引物進行檢測，將其與步驟（3）的DNA?Barcoding?數據庫中的序列長度進行比對，從而確定其是否為常見9種魚類中的某種。

通過上述方法，先建立對應特定引物的準確的含有常見魚類COI序列長度的DNA?Barcoding?數據庫，在后續檢測新的待測樣品是否為該9種魚時只需進行序列長度比對即可進行鑒定得到準確結果。

其中，在上述方法中，采用酚氯仿抽提法提取DNA。

具體的說，通過上述方法篩選得到了一對具有良好PCR擴增性能的引物（F-BaL1475/F-BaH1752：CCCGTCTCTGTGGCAAAAGAG/TGGCTGCTTTTAGGCCCAC）。

通過上述引物，得到的9種常見魚類DNA?Barcoding?數據庫如下表1所示：

表1:DNA?Barcoding數據庫

具體實施方式

1、從魚類中提取DNA：

參考《分子克隆試驗指南》，略有修改：（1）每份樣品取10mg肌肉組織，用眼科解剖剪將其盡量剪碎。（2）將提取的樣品小心的裝在1.5ml的高壓滅菌離心管中，然后加600ul的SET（裂解液）。（3）向各個EP管中加入10ul的Prok（20），再加入15ul的SDS，充分混勻。（4）消化過夜，55℃水浴，使肌肉組織消化完全。（5）向各個EP管中加入等體積約600u的Tris飽和酚，搖動混勻15min,然后離心1200rpm，10min。（6）將上清液取出，裝入新的EP管中，再加等體積的Tris飽和酚，搖動混勻15min，離心12000rpm，10min。（7）取上清液，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）混勻10min，離心12000rpm,10min。（8）取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），混勻10min,離心12000prm,10min。（9）取上清液加入2倍體積的冰乙醇（約1mL），再加入1/10體積的約60uL的NaAc水平搖動，可見絮狀，白色DNA樣品出現。（10）將樣品置于-20℃冷凍30min，取出或挑出DNA或離心12000rpm,10min,DNA沉于管底。（11）將75％乙醇洗滌DNA，搖動洗滌后，離心12000rpm?5—10min。（12）棄去75％的乙醇，自然干燥后，加入適量（約50uL）TE溶解，放-20℃冰箱中保存（注意：DNA不能太干，否則難于溶于TE）。

2、針對引物的具體PCR擴增的操作