[發明專利]一種鏈霉菌發酵生產米爾貝霉素的方法及其發酵培養基

在審

• 申請號: 201410556183.5
• 申請日: 2014-10-20
• 公開（公告）號: CN105087710A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 徐海斌;朱廷恒;李春
• 申請（專利權）人: 杭州辰西生物科技有限公司
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/46
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

技術領域

本發明涉及米爾貝霉素生產技術領域，特別涉及一種鏈霉菌發酵生產米爾貝霉素的方法及其發酵培養基。

背景技術

米爾貝霉素(Milbemycins)是由鏈霉菌產生的大環內酯類抗生素，包括一系列結構上非常類似的十六元環類組分。米爾貝霉素具有強烈的殺蟲、殺螨、驅蟲及抗腫瘤等生物學活性，大多數對農業害蟲具有廣譜防治活性，用于防治如蚜、螨、黃褐天幕毛蟲、腸道寄生蟲以及其他危害作物及家畜的寄生蟲。米爾貝霉素具有作用強烈，用藥量少，對人安全無毒，不污染環境，只殺害蟲，不殺害蟲天敵等特點。可作為防止該類藥物產生抗性的復配及輪換用藥，是目前最有前途的廣譜高效新型無交叉抗性的生物殺蟲劑。

米爾貝霉素自1967年首次被日本Sankyo公司發現，以后該公司又相繼發現milbemycinA3，milbemycinA4，milbemycin等組分。美國AmericanCyanamid公司發現了另一組分LL-28249-α(Nemadectin，尼莫克汀)。目前國際上已有多個米爾貝霉素類藥品實現了商業化，被廣泛地用作獸醫藥物或作物保護農藥，有專家預測，它可以替代目前使用于作物保護的有機磷氨基甲酸酯擬除蟲菊酯類及有機氯類化合物，顯示出廣闊的應用市場。

米爾貝肟(milbemycinoxime)是鏈霉菌發酵產生的米爾貝霉素A₃和米爾貝霉素A₄基礎上的半合成的肟衍生物,是一種新型的大環內酯類驅蟲藥，對體內外寄生蟲均具有驅殺作用，對控制和預防大部分常見寄生蟲疾病都有很好的效果。通常用來預防惡絲蟲病,控制線蟲、鉤蟲引發的犬、貓疾病及犬的鞭蟲病。米爾貝肟是公認的具有廣譜、高效、安全的驅蟲藥,特別是對一些伊維菌素敏感的犬相對更為安全。目前在國內市售的米爾貝肟相關產品有用于防犬心絲蟲病的片劑“犬心安(milbemycinA)”和用于抗犬、貓耳螨的滴劑“耳螨滅(milbeMite)”等。這些都是進口藥物，由瑞士諾華制藥廠或日本三共株式會社生產，國內尚未開發出此類產品。

雖然米爾貝霉素系列產品具有廣泛的用途和市場，但由于只有日本擁有菌種資源，全球一直只有日本Sankyo公司生產milbemycinA₃和A₄原藥。我國東北農業大學向文勝等也分離到了產米爾貝霉素的菌株，冰城鏈霉菌(Streptomycesbingchenggensis)，經過菌株誘變育種改良和發酵工藝優化，米爾貝霉素的產量可達1380μg/mL。進一步利用基因工程技術進行菌株改造，米爾貝霉素的產量得到了大幅提高，達2312μg/mL（專利申請號：201310409240.2）。通過菌株改良是提高米爾貝霉素發酵效價和生產能力的有效途徑。但是這樣的改變途徑技術難度大，成本高，耗時長，成功率低。

發明內容

本發明的目的在于提供一種改良的一種鏈霉菌發酵生產米爾貝霉素的方法，顯著提高了米爾貝霉素的產量，簡單易行，適合工業化生產。

本發明的還提供了一種鏈霉菌發酵生產米爾貝霉素用發酵培養基，通過培養基的改良來提高米爾貝霉素的發酵水平，顯著提高了米爾貝霉素的產量，降低了生產成本。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種鏈霉菌發酵生產米爾貝霉素的方法，所述方法包括如下步驟：

（1）斜面活化培養：取保存的菌種，接種到斜面培養基，接菌后置于28℃的培養箱中，相對濕度40-60%，培養8-9d，得到活化菌種；

（2）種子擴大培養：從斜面培養基取種，用無菌接種環在無菌條件下從斜面培養基上刮下孢子制成孢子懸液，使其濃度為10⁷-10⁸個孢子/mL，然后取孢子懸液接種到種子培養基中，培養溫度28℃，搖床轉速220r/min，培養時間46-48h，得到種子液；

（3）發酵培養：將所得種子液接種至發酵培養基中，培養溫度28℃，搖床轉速220r/min下進行發酵培養，培養時間150-180h；

所述發酵培養基由以下質量百分比計的原料混合制成：蔗糖12-13%，棉籽餅粉0.8-1.2%，花生餅粉0.8-1.2%，脫脂奶粉0.8-1.2%，番茄醬2-2.5%，磷酸氫二鉀0.1-0.15%，大豆生物炭粉0.1-0.2%，硫酸亞鐵0.01-0.015%，沸石粉0.38-0.42%，鉬酸鈉0.004-0.006%，硫酸銅0.004-0.006%，碳酸鈣0.28-0.32%，水余量，pH7.2-7.6。