[發明專利]一種生產紐莫康定B 0的基因重組菌株及選育方法和應用

在審

• 申請號: 201410555356.1
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN104531535A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 黃和;宋萍;沈文和;秦婷婷;章人川;紀曉俊
• 申請（專利權）人: 南京天凱生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N13/00;C12N15/04;C12P21/04;C12R1/645
• 代理公司: 南京利豐知識產權代理事務所(特殊普通合伙)32256
• 代理人: 任立

1.一種生產紐莫康定B₀的基因重組菌株，其分類命名為Glarea?lozoyensis?Q45，該菌株由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏登記號為CCTCC?NO：M?2014416，保藏時期為2014年9月14日。

2.根據權利要求1所述的Glarea?lozoyensis?Q45的菌株發酵生產紐莫康定B₀的方法，其特征在于：將Glarea?lozoyensis?Q45的菌絲接種于種子培養基培養后，再接種于發酵培養基中進行發酵生產紐莫康定B₀。

3.根據利用權利要求1所述的Glarea?lozoyensis?Q45的菌株發酵生產紐莫康定B₀的方法，其特征在于，具體步驟包括：

1)將斜面培養好的Glarea?lozoyensis?Q45的菌株的菌絲接入到種子培養基中，在24-28℃，180-260rpm條件下培養2-3天，得種子液；

2)將種子液按發酵培養基體積5-15％的接種量接種于發酵培養基中，在24-28℃，200-500rmp條件下培養9-11天。

4.根據權利要求1或2所述的Glarea?lozoyensis?Q45的菌株發酵生產紐莫康定B₀的方法，其特征在于，在步驟2)的發酵過程中的第3-11天，以0.05-0.4g^-1·L^-1·h^-1的速度流加濃度為10-20％(v/v)的甘露醇。

5.根據權利要求4所述的Glarea?lozoyensis?Q45的菌株發酵生產紐莫康定B₀的方法，其特征在于，所述培養基為：

種子培養基配方為(g/L)：碳源10-70，氮源10-80g/L，KH₂PO₄0-1，FeSO₄·7H₂O0.005-0.015，MnSO₄·4H₂O?0.005-0.015，ZnSO₄·7H₂O?0.001-0.003，CaCl₂·2H₂O?0.005-0.015，CuCl₂·2H₂O?0.0001-0.0005，H₃BO₃0.0002-0.0006，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O?0.0002-0.0006；

發酵培養基配方為(g/L)：碳源40-150，氮源1-50，氨基酸0.1-20，K₂HPO₄0-3，FeSO₄·7H₂O0.005-0.015，MnSO₄·4H₂O?0.005-0.015，ZnSO₄·7H₂O?0.001-0.003，CaCl₂·2H₂O?0.005-0.015，CuCl₂·2H₂O?0.0001-0.0005，H₃BO₃0.0002-0.0006，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O?0.0002-0.0006。

6.如權利要求5所述的Glarea?lozoyensis?Q45的菌株發酵生產紐莫康定B₀的方法，其特征在于所述碳源包括葡萄糖、果糖、甘露醇、可溶性淀粉、甘油、麥芽糖、蔗糖、肉豆蔻酸中的一種或多種；所述氮源包括黃豆粉、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米蛋白粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、酵母浸出粉、玉米漿、硫酸銨、氯化銨、尿素中的一種或多種任一比例的混合物；所述氨基酸包括谷氨酸、谷氨酸鈉、脯氨酸、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸中的一種或多種任一比例的混合物。

7.根據權利要求1所述的生產紐莫康定B₀的基因重組菌株Glarea?lozoyensis?Q45的選育方法，其特征在于，包括下列步驟：

1)原生質體的制備

將Glarea?lozoyensis原始菌株接入種子培養基培養，收集菌絲，用酶解液酶解，制成原生質體；

2)原始突變子庫

將步驟1)制備的原生質體體積均分為兩組，分別采用常壓室溫等離子體(ARTP)和氯化鋰進行誘變處理，將獲得的突變株涂布于再生培養基上，挑取生長良好的菌落進行發酵測定紐莫康定B₀，挑選產量高的突變株進行斜面傳代考察穩定性，獲得多株性質穩定的高產突變株，形成突變子庫；

3)原生質體的融合

將步驟2)得到的性狀穩定的突變菌株，按照步驟1)制備原生質體，每株突變株的原生質體都等體積均分為兩組，一組采用ARTP注入滅活，另一組采用熱滅活，將兩組滅活后的原生質體混合加入融合液進行隨機融合；

4)融合子的篩選

通過步驟3)獲得的融合后的原生質體用高滲緩沖離心洗滌后，涂布于再生培養基上，挑取生長良好的菌落進行發酵測定紐莫康定B₀，得到紐莫康定B₀高產基因重排菌株；

5)以步驟4)所得的紐莫康定B₀高產基因重排菌株為出發菌株，多次重復進行步驟3)-5)的原生質體制備、融合、篩選工作；

6)遺傳穩定性考察

對步驟5)獲得紐莫康定B₀高產基因重排菌株進行遺傳穩定性實驗檢測，獲得一株產紐莫康定B₀高且穩定的突變株，即本發明所述的基因重組菌株Glarea?lozoyensis?Q45。