[發明專利]整合全血核酸提取、擴增即可視化檢測腫瘤基因突變的微流控芯片及其應用

有效

• 申請號: 201410554594.0
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN104312913A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 關明;汪驊;張心菊;吳之源;許笑;劉維薇;周丹秋
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12M1/33;C12M1/12;C12M1/00;C12Q1/68
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 竺路玲

技術領域

本發明涉及一種基因突變檢測方法和檢測芯片，尤其涉及一種整合全血核酸提取、擴增即可視化檢測腫瘤基因突變的微流控芯片、以及用所述微流控芯片進行基因突變檢測的方法。

背景技術

骨髓增殖性腫瘤(MPN)，主要包括慢性粒細胞白血病(CML)、真性紅細胞增多癥(PV)原發性血小板增多癥(ET)與原發性骨髓纖維化(PMF)等。2008年WHO血液系統腫瘤的診斷標準中，將是否存在JAK2?V617F基因突變列入PV、ET、PMF的診斷標準?，F有的突變檢測方法多為基于限制性長度多態性(RFLP)、擴增特異性突變檢測系統(ARMS)、直接測序及高分辨率熔解分析(high?resolution?melting,HRM)等技術。

其中，RFLP基于凝膠介質，其檢測操作的人力與時間成本較高、且由于存在酶切不完全，易于污染等問題，并不適合實驗室高通量篩查的需求。ARMS雖然可用于檢測簡單形式的突變，且可通過熒光定量完成單次閉管檢測，但由于反應體系過于復雜，無法對多種突變進行同時篩查。直接測序雖可直接獲得核酸的詳細序列信息，但目前技術成本仍然較高、檢測靈敏度較低(20％)，且由于雙脫氧核苷酸終止技術具有極大的致畸毒性，并不適合小規模實驗室開展檢測。HRM是新型的基因分型技術，利用異源雙鏈間的錯配所導致的熔解溫度變異，可快速可靠的完成簡單突變的篩查，但該方法對樣本前處理要求高，DNA模板中的殘余蛋白及RNA、緩沖液的離子強度等因素均可導致熔解曲線漂移進而影響結果判讀。

目前常用的HRM分析方法如傳統產物熔解分析、小片段內參法或非標記探針法的檢測靈敏度可達為5％。但JAK2?V617F突變為體細胞獲得性突變，如何提高檢測靈敏度對于提高MPN患者的早期診斷并提示臨床開展區別于反應性增生的早期治療干預具有重要的現實意義。由于這些方法均需特殊儀器，操作繁瑣，因此建立簡單、高靈敏度的用于MPN患者的早期分子診斷已為目前亟需解決的問題。

環介導等溫擴增(LAMP)是2000年日本學者發明的一種在一個溫度下進行得的基因擴增技術，此技術已成功地應用于SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測。此技術具有特異性強、靈敏度高、響應速度快、結果判定簡單、應用范圍廣、操作方便、價格低廉等特點。Minnucci等(Minnucci?G,et?al.A?novel,highly?sensitive?and?rapid?allele-specific?loop-mediated?amplification?assay?for?the?detection?of?the?JAK2V617F?mutation?in?chronic?myeloproliferative?neoplasms,Hematopoiesis,2012,97(9):1394-1400)利用LAMP技術針對JAK2?V617F突變型DNA進行了檢測，但是不能檢測出野生型及雜合型的臨床樣本，且不能實現核酸提取、擴增及檢測一體化。

微流控技術是在微米尺度結構中操控納升至皮升級體積流體的技術與科學，可以將分析裝備微型化、集成化和高通量化，直至將一個生物或化學實驗室微縮到一塊幾平方厘米的芯片上-即所謂“芯片實驗室”。由于其具有分析速度快、可集成化、便于攜帶等優點，目前已廣泛用于氨基酸、蛋白質、細胞等的檢測和分析。該技術的小尺度結構增強了流體的層流效應、表面張力效應和熱傳導效應，使許多物理和化學過程發生了質的變化，為生物分子診斷提供了廣闊的應用前景。微流控芯片(Microchip)與LAMP核酸分析技術結合可實現多重，原位，定量，高通量和高集成地分析核酸分子，對于發展強大的生物分子床邊快速診斷具有重大意義。Fang等利用LAMP-Microchip實現了甲型流感病毒的檢測(Fang?XE,et?al.Predicting?viruses?accurately?by?a?multiplex?microfluidic?loop-mediated?isothermal?amplification?chip,Anal.Chem,2011,83:690-695)，但其檢測樣本為已提取的DNA、而非全血樣品，也不能實現微流控芯片上核酸提取、擴增及檢測的一體化。

而目前針對全血的基因突變檢測，都需從全血中提取DNA或RNA，且需要相應的檢測系統，如PCR分析儀或凝膠電泳儀等，尚無用于整合全血核酸提取、擴增及基因檢測的一體化微流控芯片。

發明內容