[發明專利]一種檢測多菌靈的化學發光酶聯免疫分析法

在審

• 申請號: 201410552523.7
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN105572347A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 洪霞;杜霞
• 申請（專利權）人: 鎮江先創生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種酶聯免疫檢測試劑盒，尤其涉及一種多菌靈的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒。

背景技術

多菌靈（Carbendazin），化學名稱2-（甲氧基氨基甲酰）苯并咪唑[2-（methoxy-carbanmoyl）-benzimidaxole]，是一種高效低毒殺菌劑，可用于防治多種植物病害。多菌靈是蔬菜栽培過程中常用的一種農藥，我國蔬菜產品出口量很大，農藥殘留是一個很重要的限制指標。因此定期對多菌靈殘留進行檢測成為許多國家的監控的必要手段。歐盟規定多菌靈在蔬菜中的最高殘留限量（MRL）為0.1mg/kg。

目前，檢測多菌靈的方法主要有：高效液相色譜法(HPLC)、色/質聯用分析法(LC-MS)、液/質聯用分析法(LC-MS/MS)。薄層色譜法的缺陷是：操作過程復雜，時間長；操作人員需要經過專業培訓；影響分析的干擾因素較多，結果重復性差。放射免疫法，高效液相色譜法、色/質連用分析法、液/質聯用分析法這些理化方法的缺陷是儀器設備昂貴，樣品前處理復雜，費時，費力，不易普及，檢測費用高，特別是放射免疫法還需要配備放射源，有一定危險性。鑒于此，建立一種有效、快速、簡單、靈敏的檢測蔬菜植物中多菌靈含量的方法具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種多菌靈的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒。該試劑盒具有檢測靈敏度高、應用靈活、方便的特點。

本發明所述多菌靈的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內的酶標板和設在盒體內的多菌靈系列標準溶液、酶標羊抗兔抗體、多菌靈抗體、發光溶液、洗滌溶液、包被溶液及封閉溶液；其特征在于：

所述酶標板的各孔包被有以多菌靈與卵清蛋白偶合制成的包被抗原，其中包被抗原濃度優選10μg/mL。

所述卵清蛋白的分子量范圍優選6.7KDa~6.8KDa。

所述多菌靈系列標準溶液分別是0mg/kg，0.01mg/kg，0.03mg/kg，0.09mg/kg，0.27mg/kg和0.81mg/kg所述酶標羊抗兔抗體為辣根過氧化酶-羊抗兔IgG原液，其工作濃度優選為1:1000。

所述多菌靈抗體是由多菌靈與分子量范圍是6.7KDa~6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫動物制得的多克隆抗體，其工作濃度優選為1:1000。

所述發光液是0.01M魯米諾與0.001M對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH＝8.8)和3/10000(體積比)H₂O₂的混合液。所述魯米諾為發光底物，對甲苯酚為發光增強劑。

所述洗滌溶液是含有體積分數0.05％吐溫-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液。

所述包被溶液是每升水中含1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉的溶液，pH為9.5。

所述封閉溶液是每升洗滌溶液中含10g卵清蛋白(OVA，ovalbumin，也稱雞卵清白蛋白或雞卵白蛋白，由386aa組成，分子量約43Kd)且加入重量分數0.5％NaN₃的溶液。

本發明試劑盒最大檢測范圍為0.01mg/kg~0.81mg/kg。

本發明試劑盒中涉及的多菌靈標準溶液、酶標羊抗兔抗體溶液、多菌靈抗體溶液、發光溶液及洗滌溶液及其配方對本發明試劑盒檢測的靈敏度影響很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是：

1、多菌靈標準溶液：以常規方法配制濃度分別為0mg/kg，0.01mg/kg，0.03mg/kg，0.09mg/kg，0.27mg/kg和0.81mg/kg的多菌靈標準溶液；

2、酶標羊抗兔抗體溶液：酶標羊抗兔抗體為辣根過氧化酶-羊抗兔IgG原液，使用時用洗滌溶液配制成1:1000的工作濃度；

3、多菌靈抗體溶液：多菌靈抗體是用人工免疫抗原免疫動物制得的多克隆抗體，將所得多菌靈抗體用洗滌溶液稀釋成1:1000的工作濃度；

4、發光溶液：是0.01M魯米諾與0.001M對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH＝8.8)和3/10000(體積比)H₂O₂的混合液；

5、洗滌溶液：指含有體積分數0.05％吐溫-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液；

6、包被溶液：1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于1L水中，調節pH為9.5；