[發明專利]一種采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法

無效

• 申請號: 201410550348.8
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN104267196A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 萬亞坤;母亞雯;謝浩
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 江蘇永衡昭輝律師事務所 32250
• 代理人: 王斌

技術領域

本發明涉及生物醫學與分子免疫學領域，涉及一種降鈣素原的檢測技術。

背景技術

近年來，臨床上發現一種對全身性感染及其并發癥的有效監測的新指標，它能夠有效地反映感染導致的炎癥損傷程度---降鈣素原（PCT），當病人受到細菌、真菌、寄生蟲嚴重感染、產生膿毒癥或多臟器功能衰竭時，降鈣素原在血漿中的含量顯著高。PCT是激素降鈣素，它是由116個氨基酸組成的糖蛋白，是降鈣素（calcitonin，CT）的前體。PCT是由濾泡旁細胞甲狀腺（C細胞）以及和腸的神經內分泌細胞產生的，正常健康人體內PCT水平很低（<0.05?ng/mL）,當血清中PCT含量高于2?ng/mL時，出現敗血癥的風險較高。當發生全身性炎癥或細菌感染2至4小時內，PCT的水平會急驟升高，可提升高達5000倍，且在幾小時內維持高水平，對全身以及局部的細菌性感染的鑒別十分有利。降鈣素原(PCT)是一個具高靈敏度、高特異性的新指標，還能在早期鑒別細菌與非細菌感染，現有的數據也顯示，PCT水平的上調很少受病毒感染的影響，但可以作為血癥的預警和診斷指標，且PCT在血清中的含量高低與細菌感染的嚴重程度成正相關。監測PCT水平可以對炎癥性疾病、膿毒血癥、急性胰腺炎等全身或多種局部炎癥進行診斷，是目前最敏感和最特異的診斷指標。所以PCT的低成本、高靈敏度、快速便捷的檢測方法在臨床上具有十分重要的意義。另外，PCT水平是有關的抗生素治療的起始或終止的重要依據。但是目前市場常見的PCT檢測方法，有些是板式或管式固定包被抗原或抗體，有一定的局限性，不利于免疫反應的進行；多數利用熒光物質標記抗體，發光物質穩定性差，發光效率低、時間短；有些會造成環境污染；有些操作復雜、較難保證結果的重復性；有些檢測靈敏度低，且成本上也不具有優勢。

鄰位連接技術（proximity?ligation?assay,?PLA）是一項高靈敏度的蛋白質分析技術。此方法利用一對帶有化學基團修飾的單鏈DNA與修飾后的蛋白識別因子偶聯，與抗原共孵育，特異性地進行抗原抗體反應，然后通過連接酶的作用以及連接探針的輔助將核酸序列連接起來，并加入引物、Taqman探針和Taq酶的反應溶液，進行實時PCR，最后通過檢測熒光信號便可知道被測蛋白是否存在及含量多少。這種方法能夠將對蛋白的復雜檢測轉化為對DNA的檢測。憑借其檢測靈敏度高、檢測特異性強、樣品損耗低、操作簡單、檢測設備常見等優勢，在蛋白質含量檢測、研究蛋白質間相互作用、DNA與蛋白質間相互作用等許多蛋白質組學相關領域已經取得了很好的研究成果。目前，鄰位連接技術主要有液相、固相及細胞原位3種反應形式，可用于體外及體內實驗或檢測。

發明內容

本發明所解決的技術問題是：本發明采用科技前沿的新型蛋白檢測技術檢測臨床系統性感染及炎癥損傷指標降鈣素原（procalcitonin,?PCT）含量，可以用于臨床疾病的診斷、診斷試劑盒的研發，以及醫學和生物研究等眾多領域。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：采用一種鄰位連接技術來檢測降鈣素原的方法，其具體步驟為：?

(1)?????合成鄰位連接技術所需要的偶聯DNA——Arm1和Arm2，其核苷酸序列分別為：SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3；連接反應所用連接DNA片段，其核苷酸序列為：SEQ?ID?NO:7;?實時熒光定量反應所需擴增引物及引物探針，其核苷酸序列分別為：SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:5、SEQ?ID?NO:6；

(2)?????取含有降鈣素原多克隆抗體的樣本與DBCO試劑進行反應，使降鈣素原多克隆抗體的肽鏈N端添加NHS基團；反應完成后，?加入Tris-HCl以終止上述反應；

(3)?????將修飾有NHS基團的降鈣素原多克隆抗體分成兩份，分別與5`端?修飾有疊氮基團的單鏈DNA片段Arm1，即SEQ?ID?NO：2和3`端修飾有疊氮基團的單鏈DNA片段Arm2即SEQ?ID?NO：3進行孵育，使兩份降鈣素原多克隆抗體分別偶聯其中一種單鏈DNA片段,構成Arm1-多抗和?Arm2-多抗；

(4)?????取降鈣素原多克隆抗體加入磁珠中進行偶聯，之后加入降鈣素蛋白作為抗原進行抗原抗體特異性結合，使抗原-抗體-磁珠偶聯在一起以起到固定抗原的作用；