[發明專利]一種采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法

無效

• 申請號: 201410550348.8
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN104267196A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 萬亞坤;母亞雯;謝浩
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 江蘇永衡昭輝律師事務所 32250
• 代理人: 王斌

1.一種采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

（1）合成鄰位連接技術所需要的偶聯DNA——Arm1和Arm2，其核苷酸序列分別為：SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3；連接反應所用連接DNA片段，其核苷酸序列為：SEQ?ID?NO:7;?實時熒光定量反應所需擴增引物及引物探針，其核苷酸序列分別為：SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:5、SEQ?ID?NO:6；

（2）取含有降鈣素原多克隆抗體的樣本與DBCO試劑進行反應，使降鈣素原多克隆抗體的肽鏈N端添加NHS基團；反應完成后，?加入Tris-HCl以終止上述反應；

（3）將修飾有NHS基團的降鈣素原多克隆抗體分成兩份，分別與5’端?修飾有疊氮基團的單鏈DNA片段Arm1，即SEQ?ID?NO：2和3’端修飾有疊氮基團的單鏈DNA片段Arm2即SEQ?ID?NO：3進行孵育，使兩份降鈣素原多克隆抗體分別偶聯其中一種單鏈DNA片段,構成Arm1-多抗和?Arm2-多抗；

（4）取降鈣素原多克隆抗體加入磁珠中進行偶聯，之后加入降鈣素原作為抗原進行抗原抗體特異性結合，使抗原-抗體-磁珠偶聯在一起以起到固定抗原的作用；

（5）取步驟（3）中制備好的?Arm1-多抗和?Arm2-多抗加入上述抗原抗體反應溶液中，旋轉孵育后，以此反應溶液為模版，加入連接試劑、連接DNA片段，即：?SEQ?ID?NO:7以及實時熒光定量PCR擴增試劑，在連接酶作用下使得Arm1-多抗和?Arm2-多抗上的ＤＮＡ尾部游離的5’端和3’端與連接DNA片段的互補序列雜交，形成一個環狀的蛋白質-單鏈ＤＮＡ復合物，采用實時熒光定量ＰＣＲ擴增復合物中的單鏈ＤＮＡ部分進行檢測，其中實時熒光定量PCR反應所用上游引物為SEQ?ID?NO：4，下游引物為：SEQ?ID?NO?5，引物探針為SEQ?ID?NO：?6。

2.根據權利要求1所述的一種采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法，其特征在于：步驟（4）中取降鈣素原多克隆抗體加入磁珠中進行偶聯，之后加入不同濃度的降鈣素蛋白抗原進行抗原抗體特異性結合，其中所加的不同濃度的降鈣素蛋白分別為0ng/mL、0.005ng/mL、0.05ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL。

3.根據權利要求1所述的一種采用鄰位連接技術檢測降鈣素原的方法，其特征在于：步驟（4）中加入不同濃度的降鈣素抗原濃度分別0ng/mL、1ng/mL、100ng/mL，且各自加入10%血清混勻，模擬不同PCT含量的實際樣本，用以驗證血清對該檢測方法的影響。