[發(fā)明專利]一種脂肪酶、工程菌及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410545136.0
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號(hào): CN104480083A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆云君;劉子敏;王桂龍;徐莉;潘篤杰
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳華中科技大學(xué)研究院;華中科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/20
• 分類號(hào): C12N9/20;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 華中科技大學(xué)專利中心 42201
• 代理人: 曹葆青

1.一種脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶，其基因序列為：

(1)由SEQ?ID?No.1所示的基因序列；或

(2)與序列SEQ?ID?No.1限定的基因序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的基因序列；或

(3)SEQ?ID?No.1所示的基因序列經(jīng)增加、確實(shí)或替換一個(gè)或多個(gè)密碼子具有同等活性的由(1)衍生的基因。

2.一種工程菌，其特征在于，其宿主菌為畢赤酵母，在His位點(diǎn)處插入有如權(quán)利要求1所述的脂肪酶的基因序列。

3.如權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌在AOX1位點(diǎn)插入有分子伴侶組合基因，所述分子伴侶組合基因優(yōu)選為pGAPZAEro1p-pPICZABip，其序列為：

(1)由SEQ?ID?No.2所示的基因序列；或

(2)與序列SEQ?ID?No.2限定的基因序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的基因序列；或

(3)SEQ?ID?No.2所示的基因序列經(jīng)增加、確實(shí)或替換一個(gè)或多個(gè)密碼子具有同等活性的由(1)衍生的基因。

4.如權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述脂肪酶基因上游，具有釀酒酵母的α-factor信號(hào)肽基因序列。

5.如權(quán)利要求2至4任意一項(xiàng)所述的工程菌的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建脂肪酶基因表達(dá)載體：以用于His位點(diǎn)插入的畢赤酵母表達(dá)體系質(zhì)粒為載體，依次包含AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子、釀酒酵母的α-factor信號(hào)肽、以及如權(quán)利要求1所述的脂肪酶基因片段；

(2)構(gòu)建分子伴侶組合基因表達(dá)載體：以用于在AOX1位點(diǎn)插入功能基因的畢赤酵母表達(dá)體系質(zhì)粒為載體，插入的兩段功能性基因，其中第一功能性基因依次包含AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子和分子伴侶Bip基因片段，第二功能性基因依次包含GAP強(qiáng)啟動(dòng)子和分子伴侶ERO1p基因片段；

(3)制備脂肪酶表達(dá)轉(zhuǎn)基因工程菌：以畢赤酵母為宿主菌，將步驟(1)中構(gòu)建的脂肪酶基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入，經(jīng)過抗性篩選陽性克隆子，獲得重組工程菌；

(4)制備脂肪酶高表達(dá)工程菌，以步驟(3)中獲得的重組工程菌為宿主菌，將步驟(2)中構(gòu)建的分子伴侶組合基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入，經(jīng)過抗性篩選獲得陽性克隆子，再經(jīng)發(fā)酵定量篩選獲得如權(quán)利要求2至4任意一項(xiàng)所述的工程菌。

6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述用于在AOX1位點(diǎn)插入功能性基因的畢赤酵母表達(dá)體系質(zhì)粒為pPICZA/pGAPZA質(zhì)粒。

7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)發(fā)酵定量篩選的發(fā)酵時(shí)間為120小時(shí),接種量在1％至6％，優(yōu)選接種量為4％。

8.如權(quán)利要求1所述的脂肪酶，其制備方法，包括以下步驟：

A、將如權(quán)利要求2至4任意一項(xiàng)所述的工程菌在酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，26℃至30℃，培養(yǎng)16小時(shí)至20小時(shí)，得到種子液；

B、將步驟A中獲得的種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，接種量在3％至10％之間，培養(yǎng)8小時(shí)至10小時(shí)，補(bǔ)加碳源，培養(yǎng)至發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液OD600在150至160之間，流加甲醇和山梨醇混合補(bǔ)料，維持溶氧值在15％至50％之間，獲得發(fā)酵液；

C、將步驟B中的發(fā)酵液離心，收集上清液，即制得所述脂肪酶。

9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟B所述碳源為甘油的水溶液，其質(zhì)量濃度在40％至60％之間。

10.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟B所述甲醇和山梨醇混合補(bǔ)料，其中甲醇和山梨醇的體積比在3:1至1:3之間。