[發明專利]一種羊奶中摻雜牛奶或豆漿的快速檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201410515598.8
• 申請日: 2014-09-29
• 公開（公告）號: CN104894227A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: 張全芳;步迅;劉艷艷
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院生物技術研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及食品安全檢測技術領域，具體是羊奶中摻雜牛奶或豆漿的快速檢測試劑盒。?

背景技術

據營養學專家介紹，羊奶在國際營養學界被稱為“奶中之王”，羊奶中含有的維生素和微量元素都明顯的高于牛奶，美國、歐洲的部分國家均把羊奶視為營養佳品，在歐洲鮮羊奶的售價是牛奶的7倍。羊奶的蛋白質結構構成與人奶的基本相同，含有大量的乳清蛋白，且不含牛奶中的某些可致過敏的異性蛋白。因此，任何體質的嬰兒，特別是胃腸較弱、體質較差的嬰兒都可以接受羊奶。近年來，羊奶制品在市場上得到了消費者的認可，不少消費者選擇了喝羊奶，且羊奶制品的價格也高于普通的牛奶制品。在市場利益的驅動下，一些沒有羊奶資源的企業也紛紛推出了羊奶制品，一時間市場上真假羊奶制品難辨。有些企業在羊奶中摻入牛奶或者豆漿，冒充羊奶，嚴重侵害了消費者的利益。我國乳品工業與發達國家的差距仍然十分明顯，質量參差不齊，尤其是液態奶、奶粉及奶制品中摻假現象非常普遍，摻假手段多種多樣，不斷變換，而我國摻假檢測環節十分薄弱。在這樣嚴峻的情況下，我國奶業想得到健康的發展，就迫切需要解決上述問題，需要對大量的液態奶，奶粉及奶制品等進行實時快速的摻假測定。所以開發一種快速有效的檢測摻假問題的試劑盒勢在必行。?

目前常用的檢測技術主要有：感官鑒評、傳統實驗、近紅外光譜技術檢測、ELISA法等。這些方法存在靈敏度低、準確率不高、重復性差等缺點。以聚合酶鏈式反應(PCR)為基礎的技術已逐步成為了食品中動物源性成分種屬鑒定的核?心方法。近年來實時熒光PCR技術的飛速發展大大提高了食品中物種鑒別的效率和靈敏度，并使得成分含量的定量溯源成為可能。在目標基因選擇方面，動物細胞線粒體基因組DNA序列既具有高度物種特異性可變區，又具有保守性的保守區，這樣只需在相對保守區設計一對通用引物，在可變區設計相應特異探針，能夠保證檢測過程中不會出現物種間非特異性擴增而導致交叉和干擾，此外目前對羊奶中同時檢測牛奶和豆漿成分的熒光定量PCR檢測研究還沒報到，因此，建立一種帶有擴增內標的羊奶和牛奶及豆漿源性熒光定量PCR檢測方法將對羊奶、牛奶及奶制品安全的快速監管具有重要的創新性實踐意義。?

發明內容

本發明的目的是提供一種快速準確檢測羊奶中是否摻雜牛奶或豆漿的檢測試劑盒。?

為實現上述目的，該試劑盒包括一對羊奶和牛奶共用引物，豆漿特異引物及對應的3種檢測探針，其中還有一條人工合成外源性內參序列及相應引物和探針。?

本發明從牛、山羊或綿羊及豆漿的線粒體基因組DNA(mtDNA)的16SrRNA基因序列的物種特異性出發，探索并完善一種快速準確檢測羊奶中是否摻雜牛奶或豆漿的檢測試劑盒。?

分子信標具有高靈敏性，高特異性、相較于TaqMan探針熒光本底低，不僅可以用于基因的定量、定性檢測，還可以應用到基因點突變等分析，基于這些優點，本試劑盒采用分子信標探針(MB)法4重多色熒光定量PCR檢測技術，同時能檢測牛奶，羊奶及豆漿三種成分，而且本試劑盒中加入外源性內參作為內標，可有效避免因樣本含有PCR抑制物而產生的假陰性結果。?

本試劑盒包括：PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增的牛、羊及大豆引物混合物，對上述物種進行特異檢測的探針混合物，以及內標引物，人工構建內標質粒及探針混合物。?

本試劑盒在引物設計方面：根據NCBI數據庫中查找牛、山羊和綿羊線粒體基因組上的16SrRNA基因序列，以及大豆kti-s(GI：510514)基因序列，應用同源分析工具Clastaw軟件對其同源性比對，利用引物設計軟件Primer5.0根據篩選出的核心片段兩端相似序列設計一對通用引物，使用BeaconDesigner2.0設計特異分子信標(MB)探針，將設計好的探針和引物在NCBI數據庫中BLAST分析其特異性，進一步用在線軟件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold)確定其二級結構。探針分別采用4種不同發光基團對各個探針的5’端進行熒光素修飾，牛奶探針(NP)用CY3標記，羊奶探針(YP)用JOE標記，豆漿探針LectinP用FAM標記，內標探針(IACP)用ROX標記，3’端的淬滅基團用Dabcyl修飾。?

用于快速準確檢測羊奶中是否摻雜牛奶或豆漿的引物為：?

大豆特異引物：?

LectinF：5’CTCTACTCCACCCCCATCCACAT-3’?

LectinR：5’AGAAAGAAGGCAAGCCCATCTG-3’?