[發(fā)明專利]GDNF基因-PEI衍生物納米顆粒復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410507654.3
• 申請(qǐng)日: 2014-09-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104258417A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-01-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁偉恩;劉振國(guó);車(chē)俊怡;原明璐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K9/14;A61P25/16;A61P25/14;C12N15/87
• 代理公司: 上海卓陽(yáng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31262
• 代理人: 巫蓓麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及非病毒基因載體技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及GDNF基因-PEI衍生物納米顆粒復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

在基因治療的發(fā)展過(guò)程中，基因運(yùn)載系統(tǒng)即基因載體的研究始終是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，基因載體能否安全有效地運(yùn)載基因到指定地點(diǎn)是基因治療是否能在臨床上應(yīng)用的關(guān)鍵所在。基因載體可分為病毒型載體和非病毒型載體兩大類。雖然目前使用最多的仍然是病毒型載體，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90％以上，但病毒載體存在自身難以克服的局限性，如能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)及潛在的致癌性，制備復(fù)雜，而且所能裝載的外源DNA大小有限，使其應(yīng)用受到很大限制。于是，人們開(kāi)始著眼于非病毒型載體的研究。目前已有的非病毒型載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法有裸DNA注射、磷酸鈣介導(dǎo)、電轉(zhuǎn)移法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體及陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)等，前三者雖然沒(méi)有病毒載體的缺點(diǎn)，但轉(zhuǎn)染效率不盡如人意。陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率較高、重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清，體內(nèi)不穩(wěn)定一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題。從目前發(fā)展趨勢(shì)看，陽(yáng)離子聚合物載體在基因轉(zhuǎn)移方面呈現(xiàn)顯著優(yōu)勢(shì)。

陽(yáng)離子聚合物又稱聚陽(yáng)離子，種類很多，目前研究較多的有多肽類：聚賴氨酸、聚谷氨酸及其衍生物；多聚胺類：聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺樹(shù)狀物；聚甲基丙烯酸類：聚酰胺-胺型樹(shù)狀物、聚甲基丙烯酸乙酯2－（二甲胺）；以及一些天然高分子如殼聚糖、明膠等。這些聚合物結(jié)構(gòu)上的一個(gè)共同特點(diǎn)是分子內(nèi)含有許多氨基，在生理pH下會(huì)發(fā)生質(zhì)子化，這些質(zhì)子化的氨基可以中和DNA質(zhì)粒表面的負(fù)電荷，使DNA分子由伸展結(jié)構(gòu)壓縮為體積相對(duì)較小的DNA粒子，或?qū)⒛康幕虬谄渲校笵NA免受核酸酶的降解，它們可以作為基因載體。

陽(yáng)離子聚合物-DNA復(fù)合物主要是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞，形成內(nèi)含體（endosome），DNA從內(nèi)含體釋放，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，再進(jìn)一步進(jìn)入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。

PEI衍生物為聚陽(yáng)離子中的一種，結(jié)構(gòu)式為：

，

其中，X可以是苯二甲醛、吡啶二甲醛、噠嗪二甲醛或咪唑二甲醛，聚乙烯亞胺與X以亞胺鍵連接。

????GDNF蛋白（由GDNF基因編碼）對(duì)發(fā)育的和成熟的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元都有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性，其對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的作用是迄今發(fā)現(xiàn)的基因當(dāng)中最強(qiáng)的，可以促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、分化及代謝活性，且對(duì)胚胎期或出生后損傷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元都有很強(qiáng)的修復(fù)作用。GDNF蛋白對(duì)神經(jīng)元特別是多巴氨能神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元所具有的明顯修復(fù)損傷作用，為帕金森病的治療提供了可能。

目前關(guān)于使用GDNF基因與由低分子量PEI和苯二甲醛、吡啶二甲醛、噠嗪二甲醛或咪唑二甲醛共聚形成的PEI衍生物構(gòu)成的納米顆粒復(fù)合物治療帕金森病還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種GDNF基因-PEI衍生物納米顆粒復(fù)合物。

本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的GDNF基因-PEI衍生物納米顆粒復(fù)合物的制備方法。

本發(fā)明的另一的目的是，提供所述的GDNF基因-PEI衍生物納米顆粒復(fù)合物的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種GDNF基因-PEI衍生物納米顆粒復(fù)合物，它包含GDNF基因物質(zhì)和PEI衍生物，所述的PEI衍生物與GDNF基因物質(zhì)的質(zhì)量比為1~100。

所述的PEI衍生物與GDNF基因物質(zhì)的質(zhì)量最優(yōu)比為1~20。

它是由以下方法制備得到的：

（1）將PEI衍生物溶液快速加入到相同體積的GDNF基因溶液中，混合均勻；

（2）將混合溶液于室溫下孵育20～30分鐘，即得GDNF基因-PEI衍生物納米顆粒復(fù)合物。

所述的PEI衍生物結(jié)構(gòu)式為：

，

其中，PEI為低分子量聚乙烯亞胺且重均分子量≤2000Da；X為苯二甲醛、吡啶二甲醛、噠嗪二甲醛或咪唑二甲醛。

所述的PEI重均分子量≤1000Da；所述的苯二甲醛選自鄰苯二甲醛、間苯二甲醛或?qū)Ρ蕉兹龅倪拎ざ兹┻x自2,4-吡啶二甲醛、2,5-吡啶二甲醛或2,6-吡啶二甲醛，所述的噠嗪二甲醛選自2,5-噠嗪二甲醛或2,6-噠嗪二甲醛，所述的咪唑二甲醛選自2,5-咪唑二甲醛。

所述的GDNF基因-PEI衍生物納米顆粒復(fù)合物的粒徑為100～300納米。

為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：