[發明專利]一種以微衛星為分子標記篩選釀酒酵母乙酸耐受性性狀的方法

有效

• 申請號: 201410506102.0
• 申請日: 2014-09-26
• 公開（公告）號: CN104232635B
• 公開（公告）日: 2016-11-30
• 發明（設計）人: 張梁;石貴陽;肖銀;胡蕓;顧正華;丁重陽
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/865
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及釀酒酵母乙酸耐受性的篩選，特別是以微衛星ScAAT3為分子標記的篩選，屬于遺傳領域。

背景技術

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是一類重要的工業微生物，被廣泛應用于食品焙烤、啤酒、酒精、白酒、黃酒、葡萄酒、清酒的釀造和有機酸的生產等方面。釀酒酵母在進行有機酸發酵時，發酵醪液pH往往低于3.5，有時甚至達到2.5，這不利于生產菌株的生長及產物的生成，提高了生產成本。研究發現，釀酒酵母的耐有機酸能力與菌株來源、酸性物質種類和培養方式等均密切相關。因此篩選耐酸能力強的釀酒酵母生產菌株有利于提高生產效率，降低生產成本，在工業生產中有著巨大的商業價值。

傳統的釀酒酵母遺傳性狀的篩選方法主要有基因敲除法和大批量誘變篩選法。在基因敲除后酵母的表型性狀會發生改變，因此可通過基因敲除來對酵母遺傳性狀進行篩選。但由于表型性狀是由基因型與多種因素共同作用的結果，因此通過基因敲除來對酵母遺傳性狀進行篩選準確性較低。而通過誘變的方法對釀酒酵母遺傳性狀進行篩選，效率較低，且需要耗費大量的人力、物力和財力。目前，遺傳標記已成為分子生態學研究的重要手段，被廣泛用于揭示釀酒酵母遺傳多樣性。DNA標記能直接反應基因組DNA間的差異，如：單核苷酸多態性標記(SNP)，隨機擴增多態性標記(RAPD)，限制性片段長度多態性標記(RFLP)和擴增片段長度多態性標記(AFLP)等。SNP是檢測等位序列上的單個核苷酸存在的差異，因此SNP是二等位多態性，RPAD標記擴增出來的DNA片段具有隨機性和任意性，但一般表現為顯性遺傳，不能區分顯性純合和雜合的基因型；RFLP標記需要消耗大量時間且需要使用放射性標記，效率較低切操作程序復雜。AFLP標記通過選擇性擴增基因組DNA酶切片段所產生的擴增產物的多態性，該技術結合了RFLP的穩定性和PCR的技術，同時克服例如RELP帶型少，信息量小及RAPD技術不穩定的缺點。但同時也更加費時費力，程序復雜，因此有必要開發一種新的簡單快速，可靠的篩選方法。

微衛星DNA序列(SSR)，是一類由幾個(多為1-6個)堿基組成的基序串聯重復而成的DNA序列，在眾多的遺傳標記技術中，它具有不受環境影響，多態性高，特異性強，遺傳穩定，與生物表型相關度高，并能直接反映DNA序列水平的遺傳變異等特點。近年來，微衛星DNA分子標記作為新興的標記技術，以其多態點豐富、與生物表型相關度高等優點在生物遺傳多樣性、等位基因鑒定等研究方面已經取得了較好的結果，也廣泛用于釀酒酵母菌株的分類鑒定、菌株間的親緣關系分析和釀酒酵母群體遺傳多樣性分析。

本研究首次將SSR分子標記與釀酒酵母乙酸耐受性性狀相結合,探索SSR分子與釀酒酵母乙酸耐受性性狀相關性，為利用SSR對釀酒酵母乙酸耐受性性狀篩選提供一種較為有效的方法，并為以SSR為分子標記對微生物遺傳性狀進行篩選提供借鑒。

發明內容

本發明所要解決的問題是提供一種以微衛星位點為分子標記對釀酒酵母乙酸耐受性性狀進行篩選的方法。

所述微衛星位點為ScAAT3，該微衛星位點與釀酒酵母乙酸耐受性成正相關(p<0.05)，可以作為釀酒酵母乙酸耐受性性狀篩選的分子標記。

本發明要解決的另一個技術問題是以微衛星為分子標記，建立釀酒酵母乙酸耐受性與11個微衛星相關性。

選取釀酒酵母基因組中11個微衛星位點，通過PCR擴增技術對44株釀酒酵母生產菌株進行準確快速分型，并建立相關的基因型數據庫。根據實驗菌株的耐酸表型差異，利用SPSS軟件統計分析，建立釀酒酵母微衛星與乙酸耐受性性狀之間的相關性。

與傳統方法相比，本發明提供的以微衛星ScAAT3為分子標記對釀酒酵母乙酸耐受性進行篩選的方法，具有豐度高、多態性高、共顯性標記、可以鑒別出雜合子和純合子，實驗重復性好，結果可靠，選擇中性、可自動化檢測分析等特點，具有廣闊的應用價值。

附圖說明

圖144株菌乙酸耐受性表型鑒定結果

圖2釀酒酵母在ScAAT3和AT-X位點處的等位基因多態性

具體實施方式

YPD培養基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L

醋酸母液：配置5mM的醋酸溶液，用NaOH調節其pH至4.5，現配現用。

YPD醋酸平板：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L、瓊脂粉2g，pH4.5，滅菌后分別添加終濃度為50、70、90和110mM的醋酸母液。