[發明專利]用于rs8099917單核苷酸多態性的直接熒光PCR檢測試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201410504522.5
• 申請日: 2014-09-27
• 公開（公告）號: CN104293933B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發明（設計）人: 曹亦菲;郭興中
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

(一)技術領域

本發明涉及一種單核苷酸多態性檢測的試劑盒，具體涉及一種用于rs8099917位點單核苷酸多態性直接熒光PCR檢測的試劑盒及其檢測方法。

(二)背景技術

rs8099917位點是白介素-28B(interleukin-28B，IL-28B)單核苷酸多態性(single?nucleotide?polymorphism，SNP)位點，研究發現該位點的C或T等位基因多態性與丙型肝炎病毒(HCV)感染后病毒清除能力和疾病進展高度相關。

丙型病毒性肝炎是一種由HCV感染引起的病毒性肝炎，據世界衛生組織統計，全球HCV的感染率約為3％，呈全球性流行。IL-28B基因型是基因1型慢性HCV感染采用PEG-IFN聯合RBV或蛋白酶抑制劑三聯方案治療前重要的預測指標。聯合PEG-IFN和RBV治療后獲得SVR及HCV感染自發清除的可能性取決于IL-28B附近核苷酸序列和19號染色體上的IFNγ的基因片段。其中IL-28B基因rs8099917位點單核苷酸多態性與HCV感染后病毒清除能力和疾病進展高度相關，研究發現rs8099917GG型患者對病毒治療無效。

絕大多數疾病的發生與環境因素和遺傳因素的綜合作用有關，通常認為是在個體具有遺傳易感性的基礎上，環境有害因素作用而導致疾病。不同群體和個體對疾病的易感性、抵抗性以及其他生物學性狀(如對藥物的反應性等)有差別，其遺傳學基礎是人類基因組DNA序列的變異性，其中最常見的是SNP。SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90％以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，某些SNP直接影響蛋白的結構表達及遺傳穩定性等。隨著人類基因組計劃的進展，人們愈來愈相信基因組中的SNP有助于解釋個體的表型差異、不同群體和個體對疾病，特別是對復雜疾病的易感性以及對各種藥物的耐受性和對環境因子的反應。因此，尋找和研究SNP已成為人類基因組計劃的內容和目標之一。

通過對IL-28B?rs8099917位點單核苷酸多態性的檢測，可篩選出治療效果好的人群，果斷進行抗病毒治療，對治療預期無效患者，建議更改或等待更好治療方案，從而實現對丙型肝炎抗病毒個體化治療指導；檢測國際公認的丙肝治療相關的關鍵性SNP位點rs8099917，不僅可指導傳統的IFN+RBV丙肝治療，還可用于最新的蛋白酶抑制劑類藥物治療丙肝的指導。

臨床針對SNP位點常用的檢測方法有DNA直接測序、熒光PCR等，DNA直接測序操作繁瑣費時且敏感度低，而熒光PCR技術因其靈敏度高、特異性強、操作簡便等特點在多種醫學檢測領域得到廣泛應用。目前已經在臨床上應用的熒光PCR檢測試劑和方法多達上千種，常規通過熒光PCR檢測核酸的方法一般需要兩個獨立的過程：一是核酸模板制備，二是將核酸模板加入反應體系中進行PCR擴增檢測。一般核酸模板制備過程基本一致，都需要經過消化裂解、吸附純化、洗滌收集等步驟。單個樣本的處理往往耗時數十分鐘，對大量樣本進行處理時，耗時甚至比PCR檢測反應更長。由于繁多的操作步驟，在大樣本處理過程中，樣本之間的相互污染也不可避免。

直接熒光PCR技術采用優化的PCR緩沖液體系和特殊的DNA聚合酶，減少樣本中存在的多種抑制劑對PCR反應的干擾，具有強活力、高穩定性、強耐受性等特點。該技術無需進行昂貴又費時的核酸抽提過程，使用人標本或病原體保存液即可直接用于PCR擴增鑒定，極大的縮短了檢測時間和簡化操作步驟。

本發明針對IL-28B基因rs8099917位點多態性序列設計特異性引物探針，采用ARMS引物增敏結合Taqman探針和優化的PCR反應體系的直接熒光PCR技術，提供一種直接熒光聚合酶鏈反應(熒光PCR)定性檢測rs8099917位點單核苷酸多態性的試劑盒，縮短PCR檢測時間和簡化操作步驟，低成本快速檢測rs8099917位點多態性，能夠明確樣本中核酸片段rs8099917位點基因多態性。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種用于rs8099917位點單核苷酸多態性檢測的直接熒光PCR檢測試劑盒，明確樣本中核酸片段rs8099917位點基因多態性，本發明采用直接熒光PCR技術作為檢測方法，直接以樣本做模板進行檢測，縮短PCR檢測時間和簡化操作步驟。

本發明采用的技術方案是：