[發明專利]抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子的制備方法

在審

• 申請號: 201410503521.9
• 申請日: 2014-09-26
• 公開（公告）號: CN105497867A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 陳慶忠;安同偉;劉芳
• 申請（專利權）人: 天津嘉瑞生物科技有限公司
• 主分類號: A61K38/02
• 分類號: A61K38/02;C07K1/34;A61P31/20
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子的制備方法，其特征 在于，按照以下步驟進行：

(1)制備病毒抗原：將雞傳染性喉氣管炎病毒接種于9-11日齡 的雞胚尿囊液中，33℃-37℃溫箱孵育，24h內死亡的雞胚棄去，120h 后收集有明顯痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌 后，置于組織勻漿機內制成懸液，-20℃—-40℃冰箱內保存備用；

(2)提取病毒抗原：將步驟(1)中得到的懸液反復凍融3-5次 后，裝入厚壁小瓶子內，超聲15-20min，4℃、5000rpm離心20-30min， 棄去沉淀，收集上清液，將上清液經4℃、7000rpm離心20-30min， 棄去沉淀，收集上清液，經4℃、25000rpm離心20-30min，棄去上 清液，取沉淀，用等體積PBS溶液溶解。將上述溶液裝入以15％、 30％、45％、60％及80％的蔗糖制備的不連續梯度密度離心管，超速 離心，4℃、15000-20000rpm離心2-4h，根據雞傳染性喉氣管炎病毒 的分子量確定雞傳染性喉氣管炎病毒所在位置，吸出并置于 -20℃—-40℃冰箱內保存備用；

(3)將步驟(2)制備病毒抗原免疫豬：挑選健康免疫豬，取步 驟(2)制備的病毒抗原，采用皮下多點免疫方法，注射免疫豬，共 免疫3-4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原， 以高速組織勻漿機打勻，在動物皮內或皮下多點注射免疫，第3次和 第4次后在動物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免 疫7-10天后取動物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測上述 病毒的特異性抗體效價，出現病毒特異性免疫效價后，宰殺動物，取 脾臟和胸腺于冰上，轉移至-20℃—-40℃保存，備用；

(4)從步驟(3)得到的免疫豬中提取抗雞傳染性喉氣管炎病毒 轉移因子：

①原材料的制備及預處理：取步驟(3)接種雞喉氣管炎病毒免 疫豬的脾臟、胸腺及淋巴結組織，用冷三蒸水洗凈豬的脾臟，去除表 面筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復沖洗；

②破碎:將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水， 在冰凍的條件下用高速組織搗碎機以1000r/min搗碎3次，每次3min， 制得勻漿液；

③凍融:將勻漿液置于-80℃快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍 融4-8次，每次融化后均以組織勻漿機高速勻漿粉碎；

④提取:加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機于5℃以 4000r/min離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾， 取濾液；

⑤超濾:將上述濾液用截流值為5000道爾頓的中空纖維超濾膜加 壓超濾，濾液為分子量小于5000道爾頓的轉移因子；

⑥除菌:將超濾得到的濾液用孔徑為0.1-0.22um的濾膜加壓過濾 除菌；

⑦分裝：4℃密封保存，即得所述的抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉 移因子提取液。