[發(fā)明專利]一種扎伊爾型埃博拉病毒的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410503330.2
• 申請(qǐng)日: 2014-09-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104313179B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐昌平;盧亦愚;馮燕;陳寅;高見(jiàn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種針對(duì)扎伊爾型埃博拉病毒核酸的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)，適合對(duì)扎伊爾型埃博拉病毒的定性檢測(cè)。

(二)背景技術(shù)

埃博拉出血熱是由埃博拉病毒感染引起的一種高度接觸性烈性傳染病，感染人類后可引起嚴(yán)重的急性出血熱，易人傳人，致死率高達(dá)70-90％。埃博拉病毒具有囊膜，基因組不分節(jié)段，為單鏈負(fù)股RNA，屬于單負(fù)股病毒目絲狀病毒科絲狀病毒屬。埃博拉病毒含有一個(gè)線性RNA基因組，長(zhǎng)約19Kb，含有7個(gè)基因，依次編碼核蛋白(NP)、病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP35，VP40)、糖蛋白(GP)、額外病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP30，VP24)、RNA依賴RNA聚合酶(L)。埃博拉出血熱需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室手段確診，常用的方法有病毒分離、電鏡觀察、常規(guī)PCR、免疫熒光、熒光定量PCR和ELISA等。這些方法或是操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，或是敏感度不夠，需要特殊儀器設(shè)備等，不能快速獲得結(jié)果，亟待需要一種快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括如下組成：

(1)RNA提取試劑(優(yōu)選德國(guó)QIAGEN?RNA提取試劑盒(Qia-74104))；

(2)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液：包括正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交叉擴(kuò)增引物、1×Thermol?Buffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst?DNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無(wú)菌雙蒸水；其中：

所述的外圍引物分別為：

外圍正向引物：5′-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3′；

外圍反向引物：5′-TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3′；

所述兩條探針的序列分別為：

正向5’端Biotin標(biāo)記探針：

5′-Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3′；

反向5’端Fitc標(biāo)記探針：

5′-Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAACTTGAC-3′；

所述兩條擴(kuò)增交叉引物分別為：

擴(kuò)增正向引物：

5′-AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3′；

擴(kuò)增反向引物：

5′-CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3′；

(3)陽(yáng)性對(duì)照：含有扎伊爾型埃博拉病毒的糖蛋白DNA質(zhì)粒；

(4)陰性對(duì)照：無(wú)菌雙蒸水。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述的1×Thermol?buffer含有摩爾濃度為20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及質(zhì)量濃度為0.1％的Triton?X-100，pH?8.8。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽(yáng)性對(duì)照為含有長(zhǎng)189bp的扎伊爾型埃博拉病毒糖蛋白基因序列，序列如下：

TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCACGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATCTCTGAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽(yáng)性對(duì)照按如下步驟制備：

以包含擴(kuò)增區(qū)域的埃博拉糖蛋白基因片段為模板，通過(guò)兩條外圍引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒(Promega)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)T-easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒(Promega)構(gòu)建完整的含有目的基因的質(zhì)粒序列，用分光光度計(jì)對(duì)所抽提的質(zhì)粒測(cè)A₂₈₀定量并稀釋至10個(gè)拷貝/μl，-20℃保存。