[發(fā)明專利]一種扎伊爾型埃博拉病毒的恒溫擴(kuò)增檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410503330.2
• 申請日: 2014-09-26
• 公開（公告）號: CN104313179B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐昌平;盧亦愚;馮燕;陳寅;高見
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

1.一種扎伊爾型埃博拉病毒恒溫擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括下列組成：

(1)RNA提取試劑；

(2)恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液：包括正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條擴(kuò)增交叉引物、1×Thermol?Buffer，MgSO₄，dNTPs溶液，Bst?DNA聚合酶，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無菌雙蒸水；

所述正向外圍引物為：5′-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3′；

反向外圍引物為：5′-TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3′；

所述兩條探針的序列分別為：

正向5’端Biotin標(biāo)記探針5′-Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3′；

反向3’端FitC標(biāo)記探針5′-Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAAC

TTGAC-3′；

所述兩條擴(kuò)增交叉引物分別為：

擴(kuò)增正向引物：

5′-AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3′；

擴(kuò)增反向引物：

5′-CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3′；

(3)陽性對照：含有扎伊爾型埃博拉病毒的糖蛋白DNA質(zhì)粒；

(4)陰性對照：無菌雙蒸水。

2.如權(quán)利要求1所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述1×Thermol?Buffer含有摩爾濃度為20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及質(zhì)量濃度為0.1％的Triton?X-100，pH?8.8。

3.如權(quán)利要求1所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述陽性對照為含有長189bp的扎伊爾型埃博拉病毒糖蛋白基因序列，序列如下：

TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCACGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATCTCTGAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。

4.如權(quán)利要求1所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述陽性對照按如下步驟制備：

以包含擴(kuò)增區(qū)域的埃博拉糖蛋白基因片段為模板，通過兩條外圍引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過T-easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒構(gòu)建完整的含有目的基因的質(zhì)粒序列，用分光光度計對所抽提的質(zhì)粒測A₂₈₀定量并稀釋至10個拷貝/μl，-20℃保存。

5.如權(quán)利要求1所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液組成為：兩條外圍引物各自10pmol，兩條探針各自20pmol，兩條交叉引物各自40pmol，1×Thermol?buffer，MgSO₄為6mmol，dNTPs溶液各0.4mmol，Bst?DNA聚合酶8U，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U，無菌雙蒸水組成補(bǔ)足至25μl。

6.一種權(quán)利要求1所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫擴(kuò)增檢測試劑盒的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為：

a)用試劑盒中RNA提取液從待檢測的標(biāo)本中提取RNA；

b)將步驟a)提取得到的RNA作為模板加入到裝有恒溫擴(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，在58℃下擴(kuò)增反應(yīng)35分鐘；陽性對照PCR管中加入標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，陰性對照PCR管中加入標(biāo)準(zhǔn)陰性模板，所述陽性對照模板為含有扎伊爾型埃博拉病毒糖蛋白基因片段的質(zhì)粒，所述陰性對照模板為無菌雙蒸水；

c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸試紙條防污染檢測裝置中進(jìn)行檢測，2分鐘以后判讀結(jié)果，當(dāng)試紙條的檢測線呈陽性時，說明樣品中含有扎伊爾型埃博拉病毒核酸。