[發明專利]四翅濱藜半胱氨酸蛋白酶基因克隆及其應用

有效

• 申請號: 201410497324.0
• 申請日: 2014-09-23
• 公開（公告）號: CN104371991B
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 潘洪玉;余剛;李敬濤;孫新華;賈承國;劉金亮;張祥輝
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N15/57;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司22201
• 代理人: 邵銘康,朱世林

技術領域

本發明屬植物基因工程技術領域，尤其涉及使用釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSc1菌株表達與植物抗逆(具體為鹽和干旱)相關的蛋白AcCysP1，同時采用實時熒光定量PCR(實時PCR，Real-Time-PCR，)的方法來研究該基因對非生物脅迫NaCl和PEG的功能。

背景技術

目前農業生產中逆境脅迫是影響糧食產量最重要的因素和挑戰之一。農作物在整個生長季節中，會受到各種逆境因素的影響，如生物脅迫的病蟲害等及非生物脅迫的鹽、堿、高溫、低溫、干旱等，這些脅迫限制了植物的生長發育，最終會導致作物產量降低，品質下降，直接影響甚至威脅到糧食安全，在這些嚴重影響作物生產的逆境因子中，極端溫度、干旱、高鹽、營養失調(包括礦物質中毒和礦物質缺乏)是影響作物產量的主要限制因子，每年直接從鹽、堿、干旱、低溫脅迫等逆境造成的農作物減產仍然超過總產量的20％，而干旱和鹽脅迫是最主要的制約因素。因此，研究與非生物脅迫有關的基因并將其導入作物進行分子育種引起了科研工作者的廣泛興趣，而通過基因工程的方法進行逆境相關基因的克隆及其功能的解析能夠為植物抗逆育種提供有價值的信息和材料。然而，從直接解決農業生產中關鍵問題的角度來看，在農業生產上能起顯著作用的轉基因作物種類還不多，人類對植物逆境適應性分子機理的研究還遠遠不夠，遠不能滿足植物分子育種的需求，同世界發達國家相比，我國擁有自主知識產權和具有重要利用價值的基因相對較少。同時，目前的研究也主要集中在草本植物，而對木本植物及其耐鹽和干旱的分子遺傳研究也相對較少。然而，草本和木本植物在結構、生長、發育、生理、及在應對生物和非生物脅迫等方面存在較大的差異性。所以，從木本植物中尋找抗逆相關的基因并進行研究，能夠為通過基因工程提高作物的生物和非生物脅迫耐受性這種手段提供更多的候選基因。

四翅濱藜(Atriplex canescens[Pursh]Nute)是一種鹽生灌木，在分類上為藜科，濱藜屬，普遍存在于干旱、半干旱地區，具有較強的耐干旱、抗鹽堿、耐寒冷和耐重金屬的特性，尤其是耐干旱和鹽特性。四翅濱藜在每年降雨量≥180mm的干旱半干旱地區，年平均氣溫僅為5℃左右的低溫地區，甚至在極端低溫為-40℃地區以及鹽堿地等惡劣環境下依然生長良好，同時在海拔2000米左右的地區也適合生長，根據已有報道，四翅濱藜被有些國家稱為“生物脫鹽器”，它一年時間就可以從6.07畝的土地上吸收到1噸以上的鹽分，灌木生物量也能達到15t/hm²，枝葉中的粗蛋白含量在12％以上，高產優質、富含營養，相關科學家們認為，四翅濱藜有及其豐富的營養價值和可觀的飼料用途，因此成為了荒漠、半荒漠干旱地區非常有價值的優良飼料灌木樹種。同時，四翅濱藜還具有積累硒的能力，因此在美國也廣泛用于水土保持和路坡固定，但牧場改良仍然是其主要用途。近年來，四翅濱藜先后在中國的新疆，甘肅，寧夏，青海和其它地方種植，通過大量研究，充分體現了四翅濱藜較強的抗鹽，堿，干旱，低溫，貧瘠等優良特性，漸漸成為綠化和水土保持的優良樹種。

釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)具有典型的真核系統，是二倍體，它在蛋白翻譯后加工過程中能形成二硫鍵，具有糖基化以及蛋白折疊等特征，使得其基因表達模式更加接近于真核植物中的表達模式，它還具有生長快速、遺傳操作簡便和易于培養等的優點，所以在對植物功能基因的相關研究中，用酵母表達系統篩選具有原核表達系統不可替代的優勢性。釀酒酵母菌株INVSc1(基因型為MATa his3D1leu2trp1-289ura3-52)是經過人工改造后的尿嘧啶營養缺陷型菌株，該菌株的酵母轉化子運用SC-U缺培養基篩選時，假陽性低，轉化效率高，因此是理想的酵母表達菌株。利用酵母營養缺陷型菌株對植物cDNA文庫的研究和挖掘，在植物中受到越來越多關注。Frommer等和Hsu等(1993年)在篩選擬南芥cDNA文庫中克隆到氨基酸透過酶的NAT2/AAP1基因，該基因可以互補酵母的氨基酸轉運缺陷突變體；酵母系統研究植物耐鹽性表達基因的功能研究也被廣泛應用，Yamada等(2002年)就利用酵母轉化子來驗證丙二烯環化氧化酶(AOC)基因可以大大提高抗鹽性，進一步推測到AOC基因在植物中也可能具有抗鹽功能。唐玉林等(2007年)利用酵母研究了大豆SALI3-2蛋白可以使酵母轉化子的耐鹽能力得到顯著提高，從而推測SALI3-2基因所具有的抗逆能力。由此可見，利用酵母表達外源蛋白并研究其功能已經受到廣泛應用。