[發明專利]流式細胞術方法在疫苗生產實時監測中的應用

有效

• 申請號: 201410493364.8
• 申請日: 2014-09-24
• 公開（公告）號: CN104198357A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 孫俊穎;劉志成;郭鵬舉
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院動物衛生研究所
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞;裘暉

技術領域

本發明涉及流式細胞術的技術應用，特別涉及流式細胞術方法在疫苗生產實時監測中的應用。

背景技術

疫苗生產過程中菌液發酵過程的控制是疫苗生產的關鍵環節。溫度、pH值、培養液的營養狀態等多種因素均影響菌液的發酵過程。因此建立簡便、快速、可靠的細菌活性檢測方法對疫苗生產的監控具有實際意義。傳統的監控疫苗生產的方法主要有培養計數法和比濁計數法，目前疫苗生產廠商對疫苗質量的控制仍然依賴于這兩種方法。培養法靈敏度高但耗時長，通常需要24h以上才能獲得結果，不能達到即時控制菌液發酵過程的目的；比濁法操作簡單但采用肉眼觀察，檢測靈敏度差，且不能區分活菌和死菌。

因此，急需一種能實時監控疫苗生產過程中活菌數目的方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種流式細胞術方法在疫苗生產實時監測中的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：流式細胞術方法在疫苗生產實時監測中的應用，是將流式細胞術方法應用于疫苗生產過程中，檢測疫苗生產過程中的活菌數；

所述的疫苗包括大腸桿菌疫苗、葡萄球菌疫苗、豬丹毒疫苗、鏈球菌疫苗、沙門氏菌疫苗、魏氏梭菌疫苗、雞毒支原體疫苗、多殺性巴氏桿菌疫苗和副豬嗜血桿菌疫苗等等。

所述的流式細胞術方法在疫苗生產實時監測中的應用，優選包含如下步驟：

(1)選擇如下所述的熒光染料中的至少兩種著染目標菌；熒光染料為對活菌細胞能進行染色的染料、對總菌數能進行染色的染料和對死菌細胞能進行染色的染料；

(2)然后用流式細胞儀檢測細菌熒光信號的變化，通過測定細菌熒光信息的變化，得到FCM圖譜；FCM圖譜具有如下參數中的至少兩種：活菌數、死菌數和總菌數；依據FCM圖譜得到活菌數的比例；

(3)通過絕對計數法得到目標菌菌液的濃度；

(4)依據步驟(2)得到的活菌數的比例和步驟(3)得到的目標菌菌液的濃度，得到目標菌的活菌量和死菌量。

步驟(1)優選為：選擇如下所述的熒光染料著染目標菌；熒光染料為對活菌細胞能進行染色的染料和對總菌數能進行染色的染料中的一種與對死菌細胞能進行染色的染料形成的組合；

步驟(1)中所述的對活菌細胞能進行染色的染料優選為CFDA-SE；熒光染料CFDA-SE可以進入細胞膜，被菌體細胞內的酯酶酶解后發出熒光，為膜滲透性染料；酶解后產物不能穿過細胞膜，染色為不可逆性，因此CFDA-SE只能染色活菌細胞；

步驟(1)中所述的對總菌數能進行染色的染料優選為SYBR?Green?I；SYBR?Green?I是一種結合于小溝中的雙鏈DNA結合染料，能與所有的雙鏈DNA相結合，與雙鏈DNA結合后，發出綠色熒光，且熒光大大增強；其最大吸收波長約為497nm，發射波長最大為520nm，SYBR?Green?I可染色所有活菌和死菌；

步驟(1)中所述的對死菌細胞能進行染色的染料優選為PI；PI(碘化丙啶，Propidium?Iodide)是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，PI為膜非滲透性染料，不能通過活細胞膜，但能穿過破損的細胞膜而對核染色，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光；

步驟(3)中所述通過絕對計數法得到目標菌菌液的濃度可通過血球計數板計數或通過流式細胞儀計數；

所述的通過流式細胞儀計數優選為通過如下步驟實現：將已知濃度的磁珠和所述的目標菌菌液混合，通過流式細胞儀檢測，通過如下公式計算得到目標菌菌液的濃度；

公式為：

(菌細胞數/磁珠數)×(每管內總磁珠數/樣品總體積)×稀釋倍數＝菌液濃度；

菌細胞數指一定時間內流式細胞儀檢測到的菌細胞數；磁珠數指一定時間內流式細胞儀檢測到的磁珠數；每管內總磁珠數指樣品檢測管內的磁珠總數；稀釋倍數指菌液的稀釋倍數。

所述的磁珠的粒徑優選為5.5μm；

所述的流式細胞術方法在疫苗生產實時監測中的應用，更優選包含如下步驟：

I、建立菌細胞的空白對照和熒光強度補償對照，確定流式細胞儀的操作參數：

①將目標菌活化，培養至對數生長期；將其中的一部分菌液滅活，滅活的菌液作為死菌對照；未經處理的菌液，為活菌對照；

②用PBS將步驟①得到的兩種細胞分別洗滌，然后用PBS重懸至OD₆₀₀為0.002～0.006，得到死菌對照菌液和活菌對照菌液；

③得到菌細胞的空白對照和熒光強度補償對照：