[發明專利]一種操縱子bacABC拷貝數倍增和敲除recA基因的地衣芽孢桿菌及其構建方法

有效

• 申請號: 201410480828.1
• 申請日: 2014-09-19
• 公開（公告）號: CN104293723B
• 公開（公告）日: 2017-04-05
• 發明（設計）人: 陳守文;彭炳;王冬;李陽;祁高富;孔素芬;陳惠超;陳曉斌
• 申請（專利權）人: 綠康生化股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P21/00;C12R1/10
• 代理公司: 福州市鼓樓區鼎興專利代理事務所(普通合伙)35217
• 代理人: 傅契克

技術領域

本發明涉及一種操縱子bacABC拷貝數倍增和敲除recA基因的地衣芽孢桿菌工程菌株。?

背景技術

桿菌肽為淡黃色或類白色粉末，無嗅，味苦，是由10種氨基酸、12個氨基酸殘基構成的多肽類抗生素，可有效抑制革蘭氏陽性病原菌和部分革蘭氏陰性菌。桿菌肽擁有在腸道內幾乎不吸收，排泄迅速，體內不殘留等優點，因此被廣泛添加于飼料中。?

?目前，桿菌肽主要生產菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus?licheniformis)和枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)，其通過微生物發酵法生產。?

桿菌肽是通過硫模板機理縮合氨基酸而成的，而操縱子bacABC為編碼桿菌肽合成過程中三個關鍵酶的基因。理論上來說，操縱子bacABC編碼的肽合成酶的增多將有利于桿菌肽的合成，根據中心法則，即DNA的信息通過轉錄和翻譯最終表現在蛋白質上，增加操縱子bacABC在菌體的拷貝數，從而提高bacABC的表達。但是，由于操縱子bacABC基因序列過長，約42kb，故無法構建含有如此大基因片段的質粒表達載體，也就無法以構建游離型或整合型質粒表達載體的方式來實現操縱子bacABC拷貝數的倍增，因此，操縱子bacABC的拷貝數增加變得極為困難。另外，recA基因為編碼細菌DNA重組蛋白的基因，染色體上存在的同源序列在細菌DNA重組蛋白的作用下會進行交換重組，對菌株保持拷貝數的穩定性不利。?

發明內容

本發明旨在提供一種能夠高產桿菌肽的地衣芽孢桿菌及其構建方法，此地衣芽孢桿菌的基因組同時具有操縱子bacABC拷貝數倍增和敲除recA基因的雙重特性。??

一種操縱子bacABC拷貝數倍增和敲除recA基因的地衣芽孢桿菌，所述菌株為地衣芽孢桿菌DW2△recA/?bacABCs?（簡稱為：Bacillus?licheniformis?DW2△recA/?bacABCs），該菌株保藏在位于武漢的中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC?NO：M2014251，保藏日期為2014年6?月12日。此菌株的基因組同時具有操縱子bacABC拷貝數倍增和敲除recA基因雙重特性，生產桿菌肽的能力強。

一種操縱子bacABC拷貝數倍增和敲除recA基因的地衣芽孢桿菌菌株的構建方法，包括以下步驟：?

（1）質粒T2（2）-ori經過限制性DNA內切酶XbaⅠ和BamH?I雙酶切得到線性的T2（2）-ori質粒，并回收線性T2（2）-ori質粒；??

（2）以地衣芽孢桿菌DW2的基因組DNA為模板，PCR分別擴增出淀粉酶終止子、啟動子和bacABC上、下游同源臂基因片段，同時，以載體pHY300為模板擴增出四環素抗性基因片段，并回收淀粉酶終止子、啟動子、四環素抗性和bacABC上、下游同源臂5個基因片段；

（3）將這5個基因片段融合，得到融合DNA片段，具體操作為：以bacABC上游同源臂和淀粉酶終止子為模板，通過soe-PCR（即重疊延伸PCR）得到第一融合片段，同時，以bacABC下游同源臂和啟動子為模板，通過soe-PCR得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四環素抗性基因片段為模板，通過soe-PCR得到融合DNA片段，融合DNA片段的正確排列順序為：bacABC上游同源臂—淀粉酶終止子—四環素抗性基因—啟動子—bacABC下游同源臂；

（4）采用限制性DNA內切酶XbaⅠ和BamHI對融合DNA片段進行雙酶切，得到酶切后的融合片段；