[發(fā)明專利]一種通過體胚發(fā)生途徑建立翠竹再生體系的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410480523.0
• 申請日: 2014-09-19
• 公開（公告）號: CN104285788A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設計）人: 張春霞;丁雨龍;魏強;林樹燕
• 申請（專利權）人: 南京林業(yè)大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術和現(xiàn)代林業(yè)生物技術領域，具體涉及一種通過體胚發(fā)生途徑建立翠竹再生體系的方法。

背景技術

翠竹為小型地被類竹種，枝葉茂密，地下鞭根系統(tǒng)龐大，是很好的地被綠化竹種和水土保持竹種，因此目前的應用需求越來越大，其經濟價值也越來越高，具有廣闊的市場前景。

由于很難得到竹子種子，竹子繁殖主要以埋鞭、埋稈、埋節(jié)等傳統(tǒng)方法為主，這些方法具有消耗母種竹量多、種苗運輸不便、勞動強度大、繁殖系數(shù)低等缺點，采用組織培養(yǎng)技術可以高效、快速地對作物品種性狀進行遺傳改良，從而為翠竹再生植株的培養(yǎng)提供一種方便、快捷和有效的方法。我國的竹子組織培養(yǎng)工作開始于20世紀90年代，闕國寧等以黃竹和印度箣竹2種叢生竹的嫩節(jié)作為外植體誘導愈傷組織，最終形成完整植株。張春霞等對翠竹、菲白竹，王光萍等對鋪地竹、辣韭矢竹等竹種進行了以芽繁芽的組織培養(yǎng)研究，大多形成完整植株。目前，這種通過以芽繁芽途徑來實現(xiàn)竹子植株的再生的技術已趨于成熟，但通過體胚再生途徑來實現(xiàn)植株的再生，報道并不多，有關對翠竹通過體胚再生途徑來實現(xiàn)植株的再生的研究未見報道。

發(fā)明內容

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的一是通過體細胞胚發(fā)生途徑建立翠竹再生體系，為進一步利用基因工程對其進行遺傳改良創(chuàng)建技術平臺；二是通過含腋芽的莖段經無菌培養(yǎng)誘導出小芽叢，小芽叢經多次繼代培養(yǎng)誘導出胚性愈傷組織，最后通過體細胞胚發(fā)生及植株再生誘導培養(yǎng)獲得再生植株，為翠竹的快速繁殖提供新途徑。

技術方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種通過體胚發(fā)生途徑建立翠竹再生體系的方法，包括以下步驟：

1）取翠竹含腋芽的莖段，先進行消毒處理，然后接種于含有4.0~6.0mg/L?6-BA的MS誘導培養(yǎng)基，光培養(yǎng)下誘導出叢芽；

2）將叢芽轉繼代于誘導胚性愈傷組織的培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)直至有胚性愈傷組織產生；

3）將誘導的胚性愈傷組織轉接于含有1.0~3.0mg/L?6-BA，或1.0~2.0mg/L?6-BA+1.0~2.0mg/L?KT的MS，光培養(yǎng)誘導體胚發(fā)生、增殖及體胚苗發(fā)生；

4）將已發(fā)生的體胚苗小芽叢轉接于含有1.0~2.0mg/L萘乙酸的MS生根培養(yǎng)基中，光培養(yǎng)誘導生根；

5）將已生根的小苗移栽于移栽基質，噴水培養(yǎng)；?移栽基質是體積比為1：1的珍珠巖與腐殖質的混合基質；

步驟（l）中，消毒處理的具體操作為：用自來水初步沖洗后洗潔精溶液洗滌浸泡，流水沖洗1-2h。采用70%乙醇和0.11?%?升汞的消毒，無菌水沖洗接種到培養(yǎng)基上。

步驟（2）中，所述誘導胚性愈傷組織的培養(yǎng)基為含有1.0~3.0mg/L?6-BA+0.1~0.5mg/L?2,4-D的MS培養(yǎng)基，或含有1.0~3.0mg/L?6-BA+0.01~0.1mg/L?NAA的MS培養(yǎng)基。

步驟（3）中，從小芽叢上取出基部產生有胚性愈傷組織的幼嫩小芽，轉接到培養(yǎng)基上進行體胚發(fā)生、增殖及體胚苗發(fā)生誘導。

其中，各步驟中的MS為含有蔗糖和瓊脂的常規(guī)MS。

有益效果：本發(fā)明采用通過含腋芽的莖段經無菌培養(yǎng)誘導出小芽叢，小芽叢經繼代培養(yǎng)誘導出胚性愈傷組織，最后通過體細胞胚發(fā)生及植株再生誘導培養(yǎng)獲得再生植株，建立再生體系的方法，可以作為翠竹遺傳轉化的研究體系，為進一步利用基因工程對其進行遺傳改良奠定了技術平臺。與現(xiàn)有技術中的翠竹組培方法相比，本發(fā)明為翠竹組織培養(yǎng)快速繁殖增添了又一條新途徑；與已有的以芽繁芽的組織培養(yǎng)技術相比，增殖系數(shù)高，是后者的1.5-2倍，規(guī)模化生產開發(fā)價值高，具有很好的經濟前景。

附圖說明

圖1是翠竹外植體接種后1周圖；

圖2是翠竹外植體接種2月后的小叢芽圖；

圖3是翠竹新出小芽及其基部白色胚性愈傷組織圖；

圖4是翠竹含有各個發(fā)育階段（包括胚性和非胚性愈傷組織、胚狀體、小芽）的愈傷組織團塊圖；

圖5是翠竹體胚發(fā)育形成的芽叢轉接至生根培養(yǎng)基圖；

圖6是翠竹體胚苗生根培養(yǎng)3周時的根圖；

圖7是翠竹體胚苗再生植株圖；

圖8是移栽成功的翠竹再生植株圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

實施例1

一種通過體胚發(fā)生途徑建立翠竹再生體系的方法，包括以下步驟：