[發(fā)明專利]PP2A拮抗劑在制備促進(jìn)肝臟再生藥物中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410477948.6
• 申請(qǐng)日: 2014-09-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105477644A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛斌;李朝軍;來(lái)珊珊;于紫涵;趙丹丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61P1/16
• 代理公司: 江蘇銀創(chuàng)律師事務(wù)所 32242
• 代理人: 何震花

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及PP2A基因，尤其涉及PP2A在制備促進(jìn)機(jī)體肝臟再生的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

肝臟是機(jī)體最大的實(shí)質(zhì)性器官，與機(jī)體代謝、儲(chǔ)存、消化以及解毒等功能密切相關(guān)。研究表明肝臟不同于其他器官，具有很強(qiáng)的再生能力，使得機(jī)體在肝細(xì)胞程序性死亡的情況下，可以維持肝臟的正常功能。

在嚴(yán)重肝病時(shí)，如酒精肝、脂肪肝以及重型肝炎導(dǎo)致的纖維化甚至肝硬化和肝癌中，肝臟功能減退，體內(nèi)有毒物質(zhì)就會(huì)蓄積，進(jìn)一步加重肝臟損害。肝移植術(shù)是目前治療終末期肝病和肝臟機(jī)械損傷的重要技術(shù)，然而由于供體緊缺、免疫排斥等問(wèn)題使得大量的肝病患者無(wú)法獲得及時(shí)有效的治療。即使可以得到有效的治療，移植的百分比，切除的技術(shù)等也會(huì)對(duì)肝臟功能再生造成很大影響。因此肝臟再生的研究具有很重要的臨床意義，但是由于肝臟的代償性修復(fù)的相關(guān)基因與其作用機(jī)制尚未明了，導(dǎo)致了其廣泛應(yīng)用于臨床的困難。

蛋白磷酸酶2A(proteinphosphatase2A，PP2A)是磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶家族中十分重要的一員，它和PP1調(diào)節(jié)了細(xì)胞內(nèi)幾乎90％的蛋白絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化。因此PP2A的生物活性可能是通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白磷酸化的水平和持續(xù)時(shí)間來(lái)對(duì)細(xì)胞代謝、DNA復(fù)制、基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化以及凋亡等生命活動(dòng)過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)。但是由于磷酸酶不具有特異性，可調(diào)節(jié)多種生命活動(dòng)，因此無(wú)法構(gòu)建簡(jiǎn)單的全敲除模型進(jìn)行研究，導(dǎo)致了PP2A在某些生理活動(dòng)中的作用難以明了。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明首先考察正常小鼠在肝切除手術(shù)后肝再生的不同時(shí)期PP2A基因的表達(dá)水平及相應(yīng)蛋白的功能活性，猜測(cè)PP2A可作為肝臟移植中促進(jìn)肝臟再生的潛在藥物靶點(diǎn)。

為驗(yàn)證上述猜想，發(fā)明人建立了肝臟PP2Acα肝臟特異性敲除小鼠模型，驗(yàn)證特異性PP2Acα敲除個(gè)體與野生型個(gè)體在肝臟損傷后代償性修復(fù)的過(guò)程中肝臟的大小、功能以及結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示PP2Acα的敲除可以延遲肝再生的終止，促進(jìn)肝細(xì)胞體積變大，同時(shí)有利于損傷后肝臟功能的恢復(fù)。同時(shí)我們?cè)隗w外肝細(xì)胞內(nèi)利用小干擾RNA對(duì)PP2Acα進(jìn)行抑制，進(jìn)一步驗(yàn)證了PP2Acα可以促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖。

根據(jù)本發(fā)明的記載和本領(lǐng)域的公知常識(shí)，抑制肝臟PP2A活性可以促進(jìn)肝臟再生。因此PP2A基因重組表達(dá)載體可以單獨(dú)或與其他有功能活性基因重組表達(dá)載體聯(lián)合，再輔以藥學(xué)上可接受的載體，可以用以制備肝臟疾病治療的藥物。

此外，還可以用特異的PP2A基因編碼的功能蛋白的干擾物質(zhì)可以單獨(dú)或與其他具有功能活性的多肽、蛋白質(zhì)、融合蛋白等聯(lián)合，再輔以藥物上可接受的載體，同樣可以用于制備肝臟疾病治療的藥物，提高患者的治療效果及生命質(zhì)量。

附圖說(shuō)明

圖1PP2Acα敲除小鼠敲除效率的檢測(cè)。提取對(duì)照小鼠和PP2Acα敲除小鼠的肝臟總蛋白，免疫蛋白印記檢測(cè)PP2Acα的表達(dá)。驗(yàn)證了PP2Acα肝臟特異性敲除小鼠構(gòu)建的成功。

圖2肝再生不同時(shí)期小鼠肝重體重比。*，與對(duì)照鼠相比，P＜0.05；**，與對(duì)照鼠相比，P＜0.01。顯示了敲除小鼠在肝再生五天后再生速度明顯大于對(duì)照小鼠(n＝7-10)。

圖3肝再生不同時(shí)期小鼠再生肝中有絲分裂相的統(tǒng)計(jì)。*，與對(duì)照鼠相比，P＜0.05；**，與對(duì)照鼠相比，P＜0.01。顯示了敲除小鼠在肝再生4天后有絲分裂相明顯高于和對(duì)照小鼠(n＝5)

圖4肝再生不同時(shí)期小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的檢測(cè)。**，與對(duì)照鼠相比，P＜0.01。顯示了PP2Acα敲除小鼠肝再生過(guò)程中血清中ALT和AST酶活性低于正常小鼠，反映了PP2Acα敲除有利于肝功能的恢復(fù)(n＝4-6)。

圖5肝再生第五天肝細(xì)胞，細(xì)胞核大小的檢測(cè)。*，與對(duì)照鼠相比，P＜0.05；**，與對(duì)照鼠相比，P＜0.01。顯示了PP2Acα敲除小鼠有利于再生肝中肝細(xì)胞的增大(n＝7)。

圖6PP2Acα干擾腺病毒干擾效率驗(yàn)證。LO2細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度為60％時(shí)更換無(wú)血清培養(yǎng)基，分別加入干擾和對(duì)照腺病毒，4小時(shí)后更換成正常培養(yǎng)基。病毒感染48小時(shí)后收取細(xì)胞樣，提RNA，定量PCR檢測(cè)PP2Acα的表達(dá)。**，與對(duì)照比，P＜0.01。

圖7干擾PP2Acα后肝細(xì)胞增殖的檢測(cè)。肝細(xì)胞接種于12孔板，分別感染PP2Acα干擾和對(duì)照腺病毒后每隔24小時(shí)進(jìn)行一次細(xì)胞計(jì)數(shù)。*，與對(duì)照比，P＜0.05；**，與對(duì)照比，P＜0.01。顯示了在肝細(xì)胞中干擾PP2Acα可以促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖。

具體實(shí)施方式