[發明專利]一種珠子參達瑪烯二醇合成酶基因及其應用

在審

• 申請號: 201410476575.0
• 申請日: 2014-09-17
• 公開（公告）號: CN104293755A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 陳平;張紹鵬;楊濤;朱聞君;陳燕;曾萬勇;伍翀;王如峰;鄧琛;陳超;霍夢蕊
• 申請（專利權）人: 陳平;張紹鵬;楊濤;朱聞君;陳燕;曾萬勇;伍翀;王如峰;霍夢蕊;鄧琛;陳超
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于生物技術領域，主要涉及珠子參中達瑪烯二醇合成酶(Dammarenediol-II?s?ynthase,DS)基因的克隆和應用，

背景技術

珠子參是五加科人參屬(Panax?L.)植物。珠子參又名扣子七、鈕子七、珠兒參，系五加科植物珠子參[Panax?japonicus?C.A.Mey.var.major(Buck.)C.Y?Wu?et?K.M.F?eng]或羽葉三七[Panax?japonicus?C.A.Mey.var.bipinnatifidus(Seem.)C.Y.Wu?et?K.M.F?eng]的干燥串珠狀根莖。珠子參是中國藥典收載品種，主要分布在我國陜西、四川、湖北、云南等省。具有補肺、養陰、活絡、止血的功效，用于氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關節疼痛、咳血、吐血、外傷出血等。其主要活性成分為達瑪烷型四環三萜類皂苷化合物，現代研究表明達瑪烷型四環三萜類皂苷化合物具有較高的生理活性，因此本專利通過研究珠子參中活性成分達瑪烷型四環三萜類皂苷化合物生物合成的途徑及其調控的分子機制，找出其中的關鍵酶，實現其基因的定位、克隆及高效表達，在分子水平上對達瑪烷型四環三萜類皂苷化合物生物合成進行人工調控，為進一步實現珠子參中達瑪烷型四環三萜類皂苷化合物的生產提供研究基礎。

珠子參的達瑪烷型四環三萜類皂苷化合物來自于異戊二烯途徑。2，3-氧化角鯊烯的環化是三萜皂苷合成下游途徑中的關鍵步驟，這一步由達瑪烯二醇合成酶(DS)催化產生達瑪烯二醇，達瑪烯二醇在細胞色素p450單加氧酶的催化下形成達瑪烷型皂苷三萜皂苷元——原人參二醇，原人參二醇繼續在細胞色素篇p450單加氧酶的催化下轉變為原人參三醇苷元，最終形成不同類型的達瑪烷四環三萜皂苷。

迄今為止，關于珠子參活性成分代謝途徑的生物合成研究尚屬空白，珠子參中達瑪烯二醇合成酶(DS)基因的克隆研究也未見相關報道。本專利首次利用第二代Solexa?HiSeq2000進行珠子參根莖轉錄組測序及De?novo拼接。分析找到珠子參中編碼達瑪烯二醇合成酶(DS)的候選基因并進行體外克隆、表達驗證，為進一步了解該酶在珠子參植物體內基因表達、功能與作用機制奠定了研究基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因，其序列為SEQ?ID?NO.1所示。該基因編碼的達瑪烯二醇合酶在達瑪烷型皂苷化合物合成途徑中起關鍵性作用。

本發明第二個目的是提供一種珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因編碼的蛋白質，其序列為SEQ?ID?NO.2所示。

本發明的最后一個目的在于提供一種珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因在提高珠子參達瑪烷型皂苷化合物含量中的應用。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

一種珠子參達瑪烯二醇合酶基因(Dammarenediol?synthase，以下簡稱DS基因)，其制備方法如下：

以珠子參cDNA為模板，利用正向引物P1：5'-ATGTGGAAGCTGAAGGTTGCTCAAG-3'反向引物P2：5'-TTAAATTTTGAGCTGCTGGTGGT-3'進行PCR反應。

反應條件：30個PCR反應循環，94℃變性1min，42℃退火2min，75℃延伸3min。最后75℃延伸10min。

最終獲得了DS基因，其序列為SEQ?ID?NO.1所示，編碼的蛋白質為SEQ?ID?NO.2所示。

一種珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因在提高珠子參達瑪烷型皂苷化合物含量中的應用，其應用過程如下：

將珠子參達瑪烯二醇合成酶蛋白質(SEQ?ID?NO.2所示)對應的DS基因(優選SEQID?NO.1所示)通過農桿菌介導的遺傳轉化轉入珠子參，可獲得高達瑪烷皂苷含量的的轉基因植株。

本發明的所要保護的內容還包括：

編碼SEQ?ID?NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；優選SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

含有本發明的珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因全序列或部分序列的重組載體，包括但不限于原核類載體pT7-Blue，真核類表達載體pYES2、pBI?121。

含有本發明的珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因全序列或部分序列的宿主細胞，包括但不限于含有上述的重組載體的宿主細胞酵母宿主菌GIL77、大腸桿菌、珠子參。