[發明專利]一種調控小尾寒羊脂肪生長的FSTL1基因及其應用

無效

• 申請號: 201410472571.5
• 申請日: 2014-09-17
• 公開（公告）號: CN104212810A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 王建民;劉冠卿;晁天樂;張賽賽;孫艷;紀志賓;王桂芝;劉昭華;候磊
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/47
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體地說，本發明涉及一種可以調控小尾寒羊脂肪生長的FSTL1基因及其在綿羊育種中的應用。

背景技術

羊肉肉質細嫩，脂肪和膽固醇含量低，逐漸受到人們的青睞。隨著羊肉價格的逐漸盤升，提高羊只生長速度、改善羊肉品質對提高動物生產者的經濟效益、滿足廣大消費者對優質羊肉的需求具有重大意義。

FSTL1(Follistatin-like?1，又名TSC-36，FRP)卵泡抑素樣蛋白1，它最初是在研究TGF-β1作用機制時從小鼠成骨細胞系中分離獲得，同源性分析屬于SPARC蛋白家族，擁有EC結構域和FS結構域，為細胞外糖蛋白(Shibanuma?et?al.,1993)。FSTL1基因在脂肪生長發育過程中起作用，研究表明，前脂肪細胞能夠表達FSTL1基因，FSTL1表達下調可能是前脂肪細胞轉換為脂肪細胞的重要特征(Wu?Y?et?al.,2010)。因而認為該基因可能具有調節前脂肪細胞轉化、促進脂肪細胞生成的功能。另有研究報道，發現FSTL1在早期肌肉發生中起作用(尤其是胚胎期)，具體可能對肌生成調節因子如MYOD1起拮抗作用(McCarthy?JJ?et?al.,2008)；FSTL1也可能具有抑制血管平滑肌細胞的遷移與分化的作用，過表達FSTL1基因刺激血管重建和抑制心血管細胞的凋亡(Ouchi?N?et?al.,2008)。因此，在生產實踐過程中，通過調控FSTL1基因的表達能夠調節小尾寒羊骨骼肌中的脂肪含量，從而達到改善小尾寒羊肉品質的重要意義，也可以指導分子育種，應用于培育生長速度快、肉質品質好的綿羊新品種。

目前，關于FSTL1基因對脂肪生長和發育的調控還不清楚值，得深入研究。尚未見到有關小尾寒羊FSTL1基因克隆和功能的研究報道。

發明內容

基于上述的原因，本發明提供了一種可以調控小尾寒羊脂肪生長的FSTL1基因，其cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示，全長3617bp；該序列中的開放閱讀框編碼氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，共編碼307個氨基酸；該基因具有調控脂肪生長的功能，應用該基因可以通過對該基因的表達調控進行操作，實現培育生長速度快、肌肉品質好的綿羊品種奠定基礎，對養羊業生產有較高的現實意義。

本發明所提供的調控脂肪生長的FSTL1基因，cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，FSTL1的cDNA序列長3617bp，該序列中的開放閱讀框編碼307個氨基酸。

上述的FSTL1基因是通過如下方法獲得的：

(1)小尾寒羊脂肪總RNA的提取和反轉錄：

采用TRIzol法提取小尾寒羊脂肪組織總RNA，提取的總RNA用核酸蛋白分析儀進行檢測，要求總RNA吸光度OD260/280在1.8至2.0之間，并根據現有技術采用TaKaRa公司的RrimeScript^TM?RT?reagent?Kit試劑盒反轉錄合成cDNA第一鏈；

(2)FSTL1基因cDNA序列保守區的擴增：

比對已有物種FSTL1基因的cDNA序列，根據保守區設計上下游引物，以步驟(1)中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，克隆測序得到保守區序列；

(3)應用降落巢式PCR法對FSTL1基因cDNA序列的3′端進行擴增：

根據步驟(2)所得保守區序列設計FSTL1基因的3′特異性內側和外側引物；

以步驟(1)中提取的總RNA為模板，以OligodT-AP為引物，反轉錄獲得cDNA第一鏈模板；

以3′特異性外側引物和3′通用外側引物采用降落PCR法以步驟(3)中cDNA第一鏈為模板進行第一輪PCR擴增；

以3′特異性內側引物和3′通用內側引物采用同樣降落PCR法，以第一輪PCR擴增產物為模板進行第二輪PCR擴增；

對第二輪PCR產物經克隆測序得到FSTL1基因cDNA序列的3′端序列；

(4)應用RACE法對FSTL1基因cDNA序列的5′端進行擴增：

以步驟(1)中提取的總RNA為模板依次進行去磷酸化處理、“去帽子”反應、接頭序列連接反應并以TaKaRa公司的5′-Full?RACE?Kit?With?TAP試劑盒反轉錄合成cDNA的第一鏈；

根據步驟(2)所得保守區序列設計FSTL1基因的5′特異性內側和外側引物；