[發明專利]一種萊克多巴胺半抗原、人工抗原、單克隆抗體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410471148.3
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104311438B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 喬春華;吳康;許蕓蕓
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C07C229/34
• 分類號: C07C229/34;C07C227/18;C07K14/765;C07K16/44;G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 北京萬慧達知識產權代理有限公司11111
• 代理人: 張金芝,楊穎

技術領域

本發明涉及免疫檢測技術領域，具體涉及一種萊克多巴胺半抗原、人工抗原、單克隆抗體及其制備方法和應用。

背景技術

萊克多巴胺(RAC，結構式如圖1)又稱克倫巴安，是一種含有雙苯烷胺類結構的β-腎上腺素受體激動劑，是一種能夠通過與細胞膜上的β受體相結合后產生相應生理效應的人工合成的天然兒茶酚胺類似物，其作用與腎上腺素和去甲腎上腺素的作用相似，臨床上一般用于治療支氣管哮喘、支氣管痙攣等疾病，還可用于治療肌肉萎縮癥，增長肌肉，減少脂肪蓄積，并對胎兒和新生兒生長有益。

萊克多巴胺用于飼養動物時，能夠使動物體內的營養得到再分配，改變動物的營養代謝方式，減少脂肪生成，提高瘦肉率，更能迎合消費者的需求從而能夠帶來可觀的經濟效益。但是，如果β-受體激動劑在動物體內長期蓄積，則會通過食物鏈對消費者的身體健康造成威脅，嚴重時會引起心悸、肌肉震顫、惡心嘔吐等中毒癥狀，尤其是對患有心臟病、糖尿病或者高血壓的病人身體危害更大。

我國農業部在1997年頒布法令嚴禁使用β-受體激動劑作為動物飼料添加劑促進動物生長。中華人民共和國工業和信息化部、農業部、商務部、衛生部、國家工商行政管理總局、國家質量監督檢驗檢疫總局聯合發布公告，自2011年12月5日起在我國境內禁止生產和銷售萊克多巴胺。

目前，在美國、加拿大、巴西等24個國家仍允許將萊克多巴胺添加到動物飼料中來促進動物生長和提高瘦肉率，這成為非法使用者為牟取不正當利益的借口。萊克多巴胺仍活躍于市場的另一個重要原因，是目前的檢測方法達不到要求。

目前萊克多巴胺的檢測方法主要是色譜分析方法，其次是免疫分析方法。色譜分析方法雖然比較靈敏，準確度高，但需要大型儀器支持，需要繁瑣的樣品前處理以及專業的人員操作，不能適應市場對分析方法快速、簡便的要求。免疫分析方法雖然快速、簡便、特異性強、靈敏度高，不用繁瑣的樣品前處理、適合現場批量樣品的檢測等優點，但是酶聯免疫試劑盒對檢測萊克多巴胺特異性不理想，試劑盒的靈敏度不高，因此制備靈敏度高，特異性強的萊克多巴胺抗體是關鍵，而解決其問題關鍵取決于免疫半抗原的分子結構和分泌抗體的細胞系。

專利201210177057.X提供了一種萊克多巴胺半抗原、人工抗原的制備方法，雖然半抗原的合成方法簡單，純度和產率較高，但是該半抗原是以萊克多巴胺原料為基礎合成的，會增加萊克多巴胺檢測的成本。

專利CN?102924601B提供了一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，其半抗原也是以萊克多巴胺結構為基礎進行合成的，不僅生產成本相對高，而且其制備單克隆抗體的靈敏度低。

為了解決上述問題，本發明的關鍵點從基礎原料合成萊克多巴胺的類似物作為半抗原，降低檢測成本，并且半抗原最大限度上保留萊克多巴胺的原有結構，而優化免疫抗原制備雜交瘤細胞分泌大量的抗體，提高抗體的特異性，靈敏度，增強抗體與抗原的識別能力。

發明內容

為了克服現有技術的上述缺陷和不足，本發明的目的在于提供一種萊克多巴胺半抗原、人工抗原、單克隆抗體及其制備方法和應用，利用該方法制備的萊克多巴胺檢測單克隆抗體具有效價高、靈敏度高、特異性強、檢測成本低廉的特點。

本發明主要有以下技術方案實現：

一種萊克多巴胺半抗原，其結構式為下式Ⅰ：

一種萊克多巴胺半抗原的制備方法，包括如下步驟：化合物1通過溴代反應得到中間體2；所述中間體2與丙烯酸乙酯反應得到中間體3；所述中間體3經還原反應得到中間體4；所述中間體4與化合物5反應得到中間體6；所述中間體6經水解反應得到所述萊克多巴胺半抗原7；

一種萊克多巴胺半抗原的制備方法，其特征在于包括如下步驟：(a)將所述化合物1溶于乙腈中，加入N-溴代丁二酰亞胺，所述化合物1與所述N-溴代丁二酰亞胺的加入量之比為1:1～1.5倍當量，室溫下反應2-4h，得到所述中間體2；(b)在所述中間體2中加入[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀，抽換氮氣，加入三乙胺、N,N-二甲基甲酰胺和丙烯酸乙酯，再次抽換氮氣，90-110℃下回流攪拌反應15-20h，得到所述中間體3；(c)在所述中間體3中加入甲醇和催化劑Pd/C，抽換氫氣，室溫下反應3-6h，得到所述中間體4；(d)將所述中間體4溶于甲醇中，加入化合物5、三乙胺攪拌反應10-30min，加入三乙酰氧基硼氫鈉，36-60℃下回流攪拌反應20-30h后，得到所述中間體6；(e)將所述化合物6溶于甲醇中，加入NaOH，50-70℃下回流攪拌反應5-7h，得到所述萊克多巴胺半抗原RAC-CA。