[發(fā)明專利]以熒光金納米團(tuán)簇為探針的尿素測(cè)定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410468937.1
• 申請(qǐng)日: 2014-09-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104198454B
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳偉;鄧豪華;林逢林;何少斌;彭花萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇為熒光探針的尿素測(cè)定方法，屬于分析化學(xué)及納米技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

尿素是人體蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，由肝臟產(chǎn)生，經(jīng)血液運(yùn)輸至腎臟以尿液形式排出。尿素的生成量取決于蛋白質(zhì)的攝入量、組織蛋白質(zhì)的分解代謝以及肝功能狀況。尿素是臨床及生物化學(xué)一個(gè)重要的目標(biāo)分析物，它是評(píng)價(jià)尿毒癥毒素水平、腎臟及肝臟細(xì)胞功能的重要標(biāo)志。目前，尿素的測(cè)定方法包括：氨電極法、脲酶-波氏法，脲酶-谷氨酸脫氫酶偶聯(lián)法，脲酶-亮氨酸脫氫酶偶聯(lián)法等。

近年來(lái)，熒光金屬納米團(tuán)簇作為一種新型的熒光納米材料備受關(guān)注。金屬納米團(tuán)簇是指在一定的分子層保護(hù)作用下，由幾個(gè)到幾百個(gè)金屬原子構(gòu)成的分子級(jí)聚集體，其直徑一般小于2?nm，接近于電子的費(fèi)米波長(zhǎng)（約0.7?nm）。由于其獨(dú)特的物理、電學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，金屬納米團(tuán)簇在單分子光電、催化、生物成像和傳感器等領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用前景。在所有的金屬納米團(tuán)簇材料中，金納米團(tuán)簇（gold?nanoclusters，AuNCs）因其具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前研究最多的一種金屬納米團(tuán)簇材料。與小分子熒光染料和熒光蛋白相比，AuNCs用作熒光探針具有水溶性好、比表面積大、表面易于修飾、抗光漂白能力強(qiáng)以及熒光性質(zhì)可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)。因此，金納米團(tuán)簇有望彌補(bǔ)一些有毒小分子熒光染料的不足，甚至可以取代某些光穩(wěn)定性差的傳統(tǒng)熒光探針。

本發(fā)明以N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇為熒光探針，建立了一種尿素測(cè)定的新方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種以N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇為熒光探針的尿素測(cè)定方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的以熒光金納米團(tuán)簇為探針的尿素測(cè)定方法，其特征是利用脲酶特異性催化尿素生成氨和二氧化碳的體系，新生成的氨能提高所述體系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇的熒光發(fā)生猝滅，從而表現(xiàn)出熒光發(fā)射光譜特征的變化，能直接用于尿素的含量測(cè)定。

所述金納米團(tuán)簇溶液，脲酶溶液和尿素測(cè)定液按體積比為4：4：1混合，25°C反應(yīng)40分鐘測(cè)定發(fā)射光強(qiáng)度值F₆₅₀以判斷尿素的濃度。

所使用的脲酶濃度為10?U/mL。

所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制備：將濃度為0.02~0.18?mol/L?的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和濃度為0.1~0.8?mol/L的氫氧化鈉溶液加入到濃度為0.01~0.1?g/L的氯金酸溶液中，混勻，置于20~70°C水浴恒溫反應(yīng)0~3.5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行透析純化處理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金納米團(tuán)簇?zé)晒獠牧纤芤骸?/p>

所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制備：將0.6?mL濃度為0.5?mol/L的氫氧化鈉溶液與0.4?mL濃度為0.02?g/L的氯金酸溶液加入到4?mL濃度為0.08?mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37°C恒溫水浴槽中反應(yīng)2.5?h，反應(yīng)液由淺黃色變?yōu)闊o(wú)色，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行純化處理得到N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇溶液。

利用N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇在650?nm處的發(fā)射光強(qiáng)度值（F₆₅₀）以判斷尿素含量，所使用的激發(fā)波長(zhǎng)為355?nm。

將金納米團(tuán)簇溶液和脲酶溶液混合均勻后，將不同濃度尿素溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒溫水浴槽中反應(yīng)后，測(cè)定發(fā)射光強(qiáng)度值F₆₅₀，在尿素濃度為0.055~0.55mmol/L的范圍內(nèi)F₆₅₀與尿素濃度呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.055mmol/L。

本發(fā)明所述的以熒光金納米團(tuán)簇為探針的尿素測(cè)定方法，包括如下步驟：取新鮮人尿液，用pH=6.0的緩沖液稀釋，取0.05?mL稀釋液加入到由0.2?mL?N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇溶液和0.2?mL、濃度為10?U/mL的脲酶溶液組成的混合液中，在25°C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40分鐘，測(cè)定發(fā)射光強(qiáng)度值F₆₅₀，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，獲得尿液中的尿素含量。