[發明專利]基于基因沉默技術舞毒蛾幾丁質酶10基因及dsRNA

在審

• 申請號: 201410438907.6
• 申請日: 2014-09-01
• 公開（公告）號: CN104212823A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 范曉軍;趙秋勇;劉建紅;張常;糜艷霞
• 申請（專利權）人: 太原理工大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/10;C12N15/113;A01N61/00;A01P7/04
• 代理公司: 太原科衛專利事務所(普通合伙) 14100
• 代理人: 朱源;武建云

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及基于基因沉默技術的舞毒蛾致死基因片段Chitinase10及其dsRNA。

背景技術

在我國，化學藥劑連續單一長期使用已導致昆蟲對多種農藥產生了不同程度的抗藥性，例如，對于害蟲舞毒蛾需要不斷加大農藥使用量才能達到滿意的防治效果，造成了更為嚴重的環境污染，形成惡性循環。另外，舞毒蛾還會影響人類健康，當人們直接接觸舞毒蛾時，常會發生紅腫發癢現象，嚴重者甚至產生皮疹。因此，在農業生產實踐中，急需化學農藥之外的替代防治手段。

RNA干擾（RNA?interference，RNAi）是一種由雙鏈RNA介導的基因沉默現象，雙鏈RNA最終被加工大小約為22nt的小RNA（siRNA），通過序列配對的方式與蛋白編碼基因結合，根據序列配對的程度降解靶標基因mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過程。RNAi廣泛地存在于真菌、植物和動物中。2006年Andre?Fire和Craig?Mello因發現RNAi現象被授予諾貝爾醫學與生理獎。

在生物體中，一些重要的基因對維持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利用RNA干擾技術將農業害蟲中重要基因的表達進行干擾，則會引起害蟲的致畸或致死，從而達到控制害蟲的目的。

幾丁質降解和代謝是昆蟲等節肢動物體內特有的生物學現象，由于人類和其他高等動物體內不含幾丁質，因此昆蟲幾丁質降解系統已被公認為新型殺蟲劑作用的靶標。幾丁質酶在昆蟲幾丁質的降解過程中起著關鍵作用，采用RNA干擾技術，開展幾丁質酶dsRNA在害蟲防治中的應用具有重要意義。

發明內容

本發明的目的提供一種昆蟲舞毒蛾的幾丁質酶10基因和其致死基因片段，由該基因片段合成的dsRNA和dsRNA在致死害蟲舞毒蛾中的應用。

本發明是采用如下技術方案實現的：

一種舞毒蛾的幾丁質酶10基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，是通過設計昆蟲幾丁質酶的簡并引物后，PCR擴增獲得，命名為LdCHT10，其長度為604bp，編碼201個氨基酸。

上述舞毒蛾的幾丁質酶10基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，是根據SEQ?ID?NO：1設計上游引物SEQ?ID?NO：3和下游引物SEQ?ID?NO：4，經PCR擴增獲得。

進一步利用該致死片段的相關試劑盒合成dsRNA。

dsRNA在致死害蟲中的應用：注射dsRNA到舞毒蛾幼蟲的體腔內，結果表明：該dsRNA可以特異性的沉默舞毒蛾體內的幾丁質酶10基因的mRNA表達，導致舞毒蛾幼蟲因蛻皮困難死亡。

本發明設計合理，獲得了舞毒蛾的幾丁質酶5基因的致死基因片段，及由該基因片段合成的dsRNA，提供了針對害蟲舞毒蛾的一種生物學防治方法，有望減少農藥的大量使用，保護環境，降低生產成本，提高經濟收益，具有市場應用前景。

附圖說明

圖1表示6齡舞毒蛾幼蟲注射dsRNA后對其生長發育的影響。注射dsRNA的實驗組出現蛻皮困難死亡的表型（圖中，1和2為注射dsRNA的實驗組，3為注射DEPC處理的水的對照組）。

具體實施方式

實施例1

舞毒蛾幾丁質酶10基因全長的獲得方法如下：

（1）、PCR引物的設計

根據已知的昆蟲幾丁質酶10的氨基酸保守序列，設計了如下簡并性引物：

上游引物：CHT10F??5'-GACCTBGAYTGGGARTAYCC-3'，

下游引物：CHT10R??5'-GTCTTCRAAVGAHACCCATTGRTC-3'；

所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。

（2）、舞毒蛾總RNA的獲得

選取大小一致的舞毒蛾4齡幼蟲，3頭一組，冷凍于液氮中，待提取總RNA，提取總RNA的具體操作步驟按照TaKaRa的Trizol試劑盒。

（3）、舞毒蛾cDNA第一鏈的合成

cDNA第一鏈的合成的操作步驟參照PrimeScriptTM?RT?reagent?Kit?with?gDNA?Eraser試劑盒。

（4）、PCR擴增

以上述cDNA第一鏈為模板，根據Taq酶（TIANGEN）說明書進行PCR擴增，將所擴增的片段進一步克隆、測序。

（5）、序列分析

利用ExPASy分析所獲得的序列，并在NCBI網站中使用BLAST功能進行序列同源性比對，確定所獲得的基因片段為舞毒蛾幾丁質酶10基因。