[發明專利]一種直接檢測A+B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法

無效

• 申請號: 201410438234.4
• 申請日: 2014-08-29
• 公開（公告）號: CN104164518A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 于洪波;陳善光;歐陽輝;吳清華
• 申請（專利權）人: 深圳市梓健生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

技術領域

本發明屬于流感病毒定性檢測技術領域，具體涉及一種直接檢測A+B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法和試劑盒。

背景技術

流感是由流感病毒引起的一種急性傳染病。流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，為有囊膜的負鏈RNA病毒，其病毒基因組包括8個節段，為單鏈、負鏈RNA，分別編碼至少10種以上的蛋白。流感病毒包括A、B和C三種類型，造成呼吸道感染最常見的是A和B兩種流感病毒。其中，A型流感病毒又可以分為1-16種HA亞型和1-9種NA亞型；而引起感染的流感病毒的主要是A型中的H1(N1)、H3(N2)亞型和B型流感病毒。

而在現有在臨床化驗檢測的過程中，比較通用的有傳統方法和分子生物學方法兩大類。其中，傳統方法一般采用分離培養(如雞胚培養和MDCK培養)后通過血凝實驗、血凝抑制實驗、中和實驗、單放射擴散溶血技術等等進行類別確認。傳統方法，因為大量培養之后進行宏觀的實驗確認，整體操作周期產長、特異性差等。而相對傳統方法，分子生物學方法以實時PCR為基礎實驗過程對病毒核酸標樣進行擴增，然后對擴增產物分析得出靶病毒的檢測結果。實時PCR是利用不同的熒光物質來實現對擴增產物進行實時檢測的目的。其中，實時PCR最常用的兩種熒光探針是SYBR?Green?Ⅰ和Taqman探針。SYBR?Green?Ⅰ是一種熒光染料型探針，它是在實時熒光PCR反應的過程中，插入DNA雙鏈，來發射熒光信號，實現對整個反應過程的實時監測，其熒光信號的強度與DNA模板的增加量呈正相關。Taqman探針是在實時熒光PCR的反應過程中，通過與DNA模板熒光標記探針型可以采用不同熒光基團標記探針或者引物。

但是上述分子生物學方法中，首先第一個步驟是需要采用RNA試劑盒從待測的組織標樣(如咽拭子)提取RNA樣本，然后對RNA樣本進行實時PCR。由于RNA提取的步驟繁多，且RNA本身不穩定易于降解，因此采用現有的實時熒光PCR的方法耗時長，且熒光信號結果的不利于準確分析。

發明內容

本發明實施例的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種不需要RNA提取便可以直接檢測A+B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法和試劑盒。

本發明的直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒，包含有RT-PCR反應液，其中所述RT-PCR反應液為具有流感病毒裂解功能的RT-PCR反應液。

在本發明中，RT-PCR中所采用的RT-PCR反應液具有流感病毒裂解活性；立意于A型和B型流感病毒的結構非常簡單，由外層蛋白質組成的細胞膜、衣殼、以及包覆于內部核酸分子形成，而且在侵入病體后會復制和擴散的活化狀態下，本身病毒結構中簡單的結構會更加容易裂解釋放核酸。因此在本發明中采用具有A型和B型流感病毒裂解活性的RT-PCR反應液進行擴增，那么便可以直接進行RT-PCR過程；相比現有的先提取RNA樣本后再進行PCR的過程大大縮減了時間，并且大大降低了病毒RNA的降解程度，那么便可以大大提升檢測的準確性。

本發明進一步還提出直接檢測A型、B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法，在方法實施過程中采用上述具有流感病毒裂解功能的RT-PCR反應液進行。

附圖說明

下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中：

圖1為本發明實施例陽性對照中A、B型流感病毒雙重熒光RT-PCR檢測結果；

圖2為本發明實施例臨床樣本A型流感病毒的熒光RT-PCR檢測結果；

圖3為本發明實施例臨床樣本B型流感病毒的熒光RT-PCR檢測結果。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

本發明實例提供了一種直接檢測A+B型流感病毒的實時熒光RT-PCR方法，本發明的方法仍然基于實時熒光PCR的手段進行，但是相比現有熒光PCR的做法，直接采用RT-PCR步驟進行。