[發明專利]一種檢測超氧陰離子自由基含量的方法

有效

• 申請號: 201410435496.5
• 申請日: 2014-08-31
• 公開（公告）號: CN104165877B
• 公開（公告）日: 2017-03-01
• 發明（設計）人: 劉崢;李巍;魏席
• 申請（專利權）人: 桂林理工大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種利用熒光光度法快速檢測超氧陰離子自由基的方法，特別是利用噻吩-2-甲醛縮L-半胱氨酸席夫堿修飾CdTe量子點作為熒光探針檢測超氧陰離子自由基含量方法。

背景技術

超氧陰離子自由基是生物體內重要的自由基之一，也是所有活性氧自由基的前體，可以轉化為其它的活性自由基。超氧陰離子自由基與生物體發生的炎癥、衰老及癌癥等重大疾病有密切關系，因此對其檢測具有非常重要的科學意義。目前，用于檢測超氧陰離子自由基的方法包括電子順磁共振法、SOD?酶活性測定法、高效液相色譜、化學發光法、熒光分析法以及電化學方法等。在上述方法中，熒光分析法相比較而言更加具有吸引力，不僅簡單易行，便于操作，具有高靈敏度、高選擇性的特點，而且可以實現活細胞內超氧陰離子自由基的“原位可視化”，從而對它們在生命體內進行“實時在線”觀測。

本發明合成了噻吩-2-甲醛縮L-半胱氨酸席夫堿配體，利用該分子結構中的羧基對β-巰基乙胺（CA）穩定的CdTe量子點進行表面修飾，將其作為CA-CdTe量子點和超氧陰離子自由基的空間間隔物質，導致量子點熒光強度降低，在加入超氧陰離子自由基后，量子點熒光強度又有了顯著增強，據此建立噻吩-2-甲醛席夫堿修飾CdTe量子點熒光探針檢測超氧陰離子自由基濃度的高靈敏度熒光分析方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測超氧陰離子自由基含量的方法。

檢測超氧陰離子自由基含量原理是基于量子點與修飾物之間的空間間隔對量子點的熒光強度的影響。較長的間隔導致熒光強度增加而較短間隔導致熒光淬滅。CA-CdTe量子點在檢測條件下具有較強的熒光強度，用噻吩-2-甲醛席夫堿修飾后，形成QDs-席夫納米復合體系，由于空間間隔作用，使得體系熒光強度降低。而在QDs-席夫納米復合物中加入不同濃度的超氧陰離子自由基后，由于增加了體系的空間間隔，熒光強度有了不同程度的增加，且呈正相關。因此，用噻吩-2-甲醛席夫堿修飾CA-CdTe量子點為熒光探針，通過測得不同濃度的超氧陰離子自由基的熒光強度值，建立了一種新的超氧陰離子自由基的檢測手段。

在現有的QDs-席夫堿-O₂^-體系中加入多種可能對體系熒光強度有較大影響的干擾物質（8-羥基喹啉、高氯酸鋰、亞硝酸鈉、硝酸鉀、L-半胱氨酸、β-巰基乙胺），用于探究QDs-席夫納米熒光探針的選擇性。結果表明，當干擾離子濃度為1×10^-3mol/L，超氧陰離子濃度為3.3×10^-6mol/L，控制測定熒光強度的可允許誤差為±5.0%，干擾離子對QDs-席夫堿-O₂^-體系的熒光強度影響很小，與空白對照相比，熒光強度幾乎保持一致，沒有太大的變化。也就是說，當這些干擾物質加入QDs-席夫堿-O₂^-體系中時，熒光沒有受到影響。也就意味著在樣品中，可以明顯區別超氧陰離子自由基和其它物質，不會受到干擾。因此可以得出結論，所制備的QDs-席夫納米探針對超氧陰離子具有很高的選擇性和穩定性。

本發明的具體步驟為：

（1）稱取0.02g?NaOH固體溶于1mL超純水中，配制成濃度為0.5mol/L的NaOH溶液；

（2）將100μL步驟（1）配好的NaOH溶液，滴加到10mL分析純二甲基亞砜中，配成5mmol/L?NaOH的二甲基亞砜溶液，溶液中的含水量體積百分比為1%；磁力攪拌下與空氣反應30分鐘，制得超氧陰離子自由基，密封待用，超氧陰離子自由基的濃度通過朗伯比爾定律計算得出，其中在分析純二甲基亞砜中的摩爾吸收系數為20.061（mol/L）^-1?cm^-1?（波長為271nm），再根據需要，用分析純二甲基亞砜稀釋成不同濃度的超氧陰離子自由基溶液；

（3）將20mL超純水和0.242?g?L-半胱氨酸倒入三口瓶中；

（4）將10mL無水乙醇和0.224g噻吩-2-甲醛混合；

（5）磁力攪拌下在步驟（3）所得溶液中緩慢滴加步驟（4）所得溶液，25℃水浴條件下磁力攪拌反應12小時，有土黃色沉淀緩慢生成，過濾，沉淀用超純水洗滌2-3次，得到噻吩-2-甲醛縮L-半胱氨酸席夫堿，干燥待用；