[發(fā)明專利]基因全片段快速測(cè)序方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410429092.5
• 申請(qǐng)日: 2014-08-27
• 公開（公告）號(hào): CN104232761A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王凱;汪鋒;趙倩;賈海英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢凱吉盈科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務(wù)所 42212
• 代理人: 胡清堂

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因全片段快速測(cè)序方法。?

背景技術(shù)

為了獲得目的物的類型和是否具有相關(guān)突變等一系列信息，近年來(lái)各國(guó)相繼建立起病毒變異和耐藥基因序列測(cè)定的方法。基因序列測(cè)定分析法同其他方法相比，在技術(shù)上和經(jīng)濟(jì)上都具有明顯優(yōu)勢(shì)。基因序列測(cè)定分析法檢測(cè)的是易突變區(qū)域的完整序列。新一代的個(gè)人基因組測(cè)序儀，如IIIumina的MiSeq和Ion?Torrent公司的PGM，已普遍應(yīng)用與科研和臨床檢測(cè)。這些測(cè)序平臺(tái)的多用性和靈活性更適用于科研周期較快速的小型實(shí)驗(yàn)室的科研。將測(cè)序與長(zhǎng)鏈PCR結(jié)合可以為遺傳變異檢測(cè)提供更快捷更經(jīng)濟(jì)的方法。?

自聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)出現(xiàn)以來(lái)，已成為分子生物學(xué)中克隆DNA小片段不可或缺的方法之一。1992年，Barnes研發(fā)了新的PCR條件可以使擴(kuò)增片段達(dá)5KB，通過(guò)改變酶的條件，長(zhǎng)鏈PCR的擴(kuò)增片段可以從3-5KB至超過(guò)30KB。長(zhǎng)鏈PCR技術(shù)的進(jìn)步使得PCR更快速、更簡(jiǎn)潔的用于基因組圖譜和測(cè)序，并促進(jìn)分子遺傳學(xué)的研究。然而，傳統(tǒng)的PCR有擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的限制，且在實(shí)驗(yàn)中成功地?cái)U(kuò)增所有擴(kuò)增子，需要改變退火溫度和延伸時(shí)間，這是因?yàn)閿U(kuò)增子不同的長(zhǎng)度及引物具有不同Tm值。?

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了基因全片段快速測(cè)序方法，該方法結(jié)合了長(zhǎng)鏈PCR與新一代基因測(cè)序技術(shù)且PCR擴(kuò)增在相同PCR條件下即可擴(kuò)增目的片段。?

基因全片段快速測(cè)序方法，該方法包括以下步驟：?

(1)采用PrimeSTAR?GXL?DNA酶，在相同PCR條件下擴(kuò)增不同基因片段，所述PCR條件優(yōu)選96℃～100℃變性5～15sec，66℃～70℃退火延伸6～10min，25～35個(gè)循環(huán)；?

(2)標(biāo)準(zhǔn)化PCR產(chǎn)物；?

(3)制備測(cè)序文庫(kù)；?

(4)基因測(cè)序。?

本發(fā)明提供的基因全片段快速測(cè)序方法的有益效果是：本發(fā)明在相同PCR條件下擴(kuò)增不同長(zhǎng)度基因片段和不同Tm值的引物，相同退火溫度及延伸時(shí)間即可成功擴(kuò)增出目的片段，并結(jié)合MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，為長(zhǎng)鏈PCR與新一代基因測(cè)序技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用提供了一種快速有效的方法。?

附圖說(shuō)明

圖1是擴(kuò)增所得目的片段?

圖2是與遺傳性乳腺癌相關(guān)的致病突變，該突變?yōu)锽RCA2中c.5946delT?

圖3是所有樣品中存在的突變，該突變?yōu)锽RCA2中c.4563A>G?

圖4是所有樣品中存在的突變，該突變?yōu)閏.2972A>G?

圖5是樣品2,7,8存在的突變，該突變?yōu)锽RCA1中c.1941C>T和c.1936G>A?

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供的基因全片段快速測(cè)序方法，該方法包括以下步驟：?

(1)采用PrimeSTAR?GXL?DNA酶，在相同PCR條件下擴(kuò)增不同基因片段，所述PCR條件優(yōu)選96℃～100℃變性5～15sec，66℃～70℃退火延伸6～10min，25～35個(gè)循環(huán)；?

(2)標(biāo)準(zhǔn)化PCR產(chǎn)物；?

(3)制備測(cè)序文庫(kù)；?

(4)基因測(cè)序。?

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的方法予以進(jìn)一步的說(shuō)明。?

收集八位對(duì)照組患者和實(shí)驗(yàn)組1例遺傳性乳腺癌患者的外周血，提取DNA用于長(zhǎng)鏈PCR擴(kuò)增和下一代測(cè)序，以評(píng)估實(shí)驗(yàn)?zāi)芊裨谝唤M患者中穩(wěn)定使用并成功地識(shí)別陽(yáng)性突變位點(diǎn)。?

乳腺癌易感基因的快速測(cè)序方法步驟如下：?

(1)選用TaKaRa公司的PrimeSTAR?GXL?DNA酶，采用在同一溫度下退火延伸的二步法，在相同PCR反應(yīng)條件下擴(kuò)增BRCA1和BRCA2的全基因區(qū)域，BRCA1基因定位為CHR17:41196312-41279500，GRCh37/hg19，BRCA1基因定位為CHR13:32889617-32973809，GRCh37/hg19。?

PCR擴(kuò)增體系：35ng?DNA模板，2.5μmol/L的引物3.2μL，5×PrimeSTAR緩沖液4μL，1.6μL?dNTP，0.4LPrimeSTAR?GXL?DNA酶，加蒸餾水至反應(yīng)體系總體積20μL。所述引物序列見表1。?

表1?BRCA1和BRCA2基因引物序列?

*Brca1.9的擴(kuò)增反應(yīng)體系需0.4μL二甲基亞砜?