[發明專利]人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410406457.2
• 申請日: 2014-08-18
• 公開（公告）號: CN105277694B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發明（設計）人: 胡征;楊波;董俊
• 申請（專利權）人: 董俊
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/532
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 余曉雪,王敏鋒

1.一種人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡，其特征在于：所述人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡包括底板、樣品墊、結合墊、檢測層以及吸水墊；所述結合墊包被有量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針；所述檢測層是由帶有一條檢測線及一條質控線的固相硝酸纖維素膜構成；所述檢測線包被有鼠抗人A群鏈球菌M蛋白多克隆抗體；所述質控線包被有抗兔IgG；所述檢測層粘貼在底板上；所述結合墊以及吸水墊分別設置在檢測層兩端部的上方且與檢測層部分重疊后分別與檢測層以及底板粘貼在一起；所述樣品墊設置在結合墊上方且與結合墊部分重合后分別與結合墊及底板粘貼在一起；所述人A群鏈球菌是人A群鏈球菌M1，3，5，6，24血清型。

2.根據權利要求1所述的人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡，其特征在于：所述量子點是羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點。

3.根據權利要求1或2所述的人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡，其特征在于：所述抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。

4.根據權利要求3所述的人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡，其特征在于：所述檢測層長2cm，所述檢測層粘貼在長度是6.6-7.7cm的底板表面中間段；所述檢測層與粘貼在檢測層以及底板上的且長度是2.5-3cm的吸水墊重疊0.2-0.4cm；所述檢測層與粘貼在檢測層以及底板上的且長度是0.5-0.8cm的結合墊重疊0.2-0.4cm；所述結合墊與粘貼在結合墊以及底板上的長度是2.5cm的樣品墊重疊0.2—0.4cm；所述檢測線與質控線的間距是0.5-0.8cm；所述底板的寬度是0.3-0.5cm。

5.根據權利要求4所述的人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡，其特征在于：所述吸水墊是吸水濾紙；所述底板是PVC板。

6.一種基于如權利要求1-5任一權利要求所述的人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡的制備方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：

1)結合墊的制備：

1.1)重組M-His融合蛋白的制備、純化：

1.1.1)對人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白進行生物信息學分析，分別獲取其N端型特異性序列中含胞外抗原表位且不與其他抗原抗體起交叉反應的的肽段，分別標記為M1，M3，M5，M6及M24；

1.1.2)找到步驟1.1.1)中所得到五個肽段一一對應的基因編碼序列，按M1-M3-M5-M6-M24的順序進行序列拼接并根據大腸桿菌中密碼子的偏好性對該序列進行密碼子優化，在上述經密碼子優化后的重組基因的序列的5’端及3’端引入酶切位點并化學合成全基因序列，同時標記記為m；

1.1.3)將步驟1.1.2)中所得到的m按分子生物學方法克隆入表達載體pET-28a(+)后轉入大腸桿菌中表達重組M-His融合蛋白；所述重組M-His融合蛋白以可溶性表達方式存在于菌體中；

1.1.4)用鎳柱純化步驟1.1.3)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測其純度后，以Bradford法測定蛋白質濃度，調整蛋白濃度為0.2mg/mL后備用；

1.2)兔及鼠抗人A群鏈球菌M蛋白多克隆抗體IgG的制備：

1.2.1)以步驟1.1.4)中所得到的重組M-His融合蛋白為完全抗原，分別免疫新西蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人A群鏈球菌M蛋白抗血清及鼠抗人A群鏈球菌M蛋白抗血清；所述兔抗人A群鏈球菌M蛋白抗血清及鼠抗人A群鏈球菌M蛋白抗血清的間接ELISA效價均大于1×10⁵；

1.2.2)采用ProteinG親和層析柱分別純化兔抗人A群鏈球菌M蛋白抗血清及鼠抗人A群鏈球菌M蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG；

1.2.3)用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定步驟1.2.2)所得到的二種多克隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調整為3mg/mL后備用；

1.3)量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針的制備與純化：

1.3.1)向微量離心管中依次加入2nmol量子點、300nmolN-羥基琥珀酰亞胺和300nmol碳二亞胺，以磷酸鹽緩沖液定容為2ml，于旋轉混合儀中，以15rpm/min，37℃反應30min后，透析去除過量的N-羥基琥珀酰亞胺以及碳二亞胺；所述磷酸鹽緩沖液中各組分含量分別為：2.9g/L磷酸氫二鈉、0.295g/L磷酸二氫鈉以及2g/L氯化鈉，所述磷酸鹽緩沖液的pH＝7.3；

1.3.2)在活化的量子點中，加入4-12nmol的步驟1.2)所制備的兔抗人A群鏈球菌M蛋白多克隆抗體IgG，避光反應2h，加入端氨基化聚乙二醇至終濃度為1.5％，封閉未反應的活化羧基位點，繼續避光反應1h；用0.2μmPES濾器過濾除去抗體聚集物，然后將濾液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4℃下離心15min，除去未發生偶聯反應的抗體和反應中的副產物；收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶于2ml磷酸鹽洗滌液中，再將此溶液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4℃下離心15min，收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶于1ml磷酸鹽保存液中，至此制得量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針；

所述磷酸鹽洗滌液中各組分含量分別為：2.9g/L磷酸氫二鈉、0.295g/L磷酸二氫鈉、2g/L氯化鈉、5ml/L吐溫-20以及1g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽洗滌液的pH＝7.3；所述磷酸鹽保存液中各組分含量分別為：2.9g/L磷酸氫二鈉、0.295g/L磷酸二氫鈉、2g/L氯化鈉、10g/LBSA以及1g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH＝7.3；

1.4)量子點標記抗體的負載：

將聚酯纖維膜浸入步驟1.3.2)所得到的量子點標記的抗人A群鏈球菌納米探針溶液中1h，取出，25℃干燥后4℃密封保存備用，至此制得結合墊；

2)樣品墊的制備：

取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜內37℃通風干燥后，25℃密封干燥保存；至此制得樣品墊；

所述樣品墊處理液中各組分含量分別為：2.9g/L磷酸氫二鈉、0.295g/L磷酸二氫鈉、2g/L氯化鈉、20g/L牛血清白蛋白、10ml/L吐溫-20、20g/L蔗糖以及5g/L聚乙烯吡咯烷酮，所述樣品墊處理液的pH＝7.3；

3)檢測層的制備：

3.1)將步驟1.2)制備的鼠抗人A群鏈球菌M蛋白多克隆抗體與抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液均調整至終濃度為0.5-2.5mg/mL后備用；所述磷酸鹽緩沖液中各組分含量分別為：2.9g/L磷酸氫二鈉、0.295g/L磷酸二氫鈉以及2g/L氯化鈉，所述磷酸鹽緩沖液的pH＝7.3；

3.2)將稀釋好的鼠抗人A群鏈球菌M蛋白多克隆抗體裝入BIODOT劃膜儀噴頭中，設置0.8-2.5μl/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線；將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中，設置0.8-2.5μl/cm的量按照與檢測線0.5-0.8cm的間隔噴于硝酸纖維素膜上作為質控線；

3.3)將噴有檢測線以及質控線的硝酸纖維素膜在37℃干燥2h，4℃密封干燥保存；至此制得檢測層；

4)底板的制備

將PVC材質的底板按實際要求裁剪后備用；

5)吸水墊的制備

將吸水濾紙按實際要求裁剪后備用；

6)人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡的組裝：

6.1)將步驟4)所制備得到的底板上的粘性保護膜揭掉；

6.2)將步驟3)所制備得到的檢測層粘貼到底板的中部區域，并抹平膜面；

6.3)將步驟5)所制備得到的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測層有部分重疊，同時將其右邊緣與底板的右邊緣對齊粘好并抹平；

6.4)將步驟1)所制備得到的結合墊按部分重疊的方式重疊于硝酸纖維素膜的左邊緣處，同時將結合墊粘于底板上；

6.5)將步驟2)所制備得到樣品墊則按部分重疊的方式重疊于結合墊的左邊緣處，另一邊與底板的左邊緣對齊，粘于底板上并抹平；

6.6)將組裝好的人A群鏈球菌量子點免疫層析檢測卡進行裁剪，4℃密封干燥避光保存；

所述步驟6.1)至步驟6.6)均是在生物安全柜內進行操作；

所述人A群鏈球菌是人A群鏈球菌M1，3，5，6，24血清型。