[發明專利]番茄潰瘍病菌有活力菌體的流式細胞術計數方法

有效

• 申請號: 201410400015.7
• 申請日: 2014-08-14
• 公開（公告）號: CN104181093A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 羅來鑫;蔣娜;李健強;許新;劉西莉;曹永松;阮小珀
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

技術領域

本發明涉及一種活力菌體的計數方法，特別是涉及一種番茄潰瘍病菌有活力菌體的流式細胞術計數方法，屬于微生物學與植物保護學交叉領域。

背景技術

番茄潰瘍病是番茄生產中最為嚴重、具有毀滅性的病害之一。該病于1909年在美國密執安州的溫室番茄上首次發現。20世紀30年代、60年代、80年代，該病先后在美國中西部地區、北卡羅來那州及加拿大安大略地區大流行，造成的產量損失最高達80％以上。1943-1946年期間，該病在英國大流行，使番茄罐頭產業受到嚴重影響。目前，世界上60多個國家報道了該病的發生危害，遍及美洲、歐洲、亞洲、非洲和大洋洲。

我國于1954年首次有番茄潰瘍病的記載。目前，該病害在北京、天津、黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、新疆、甘肅、寧夏、青海、四川、云南、廣西、海南、河北、山西、山東、河南、安徽、上海等省、市、自治區都有發生，番茄產業受到了不同程度的影響。2007年該病原菌被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。

目前，生產上常用銅制劑或抗生素來防治番茄潰瘍病，但效果并不理想。開展種子健康檢測，從源頭上控制帶菌種子進入生產環節，或是在生產中及早發現并清除病株，是防治番茄潰瘍病的有效手段。因此，快速、特異性定量檢測有活力的番茄潰瘍病菌是種子帶菌檢測的關鍵，也是生產中亟待解決的問題。

在當前種子或植物材料攜帶有活力番茄潰瘍病菌的檢測中，基于選擇性培養基分離培養的Bio-PCR方法是被廣泛采用的標準方法，但該方法不能用于檢測處于損傷(injure)狀態或不可培養(viable?but?non-culturable，VBNC)狀態的番茄潰瘍病菌，因此可能造成假陰性的結果，給生產帶來潛在風險。

流式細胞術結合Live/Dead?BacLight試劑盒的方法能夠區分細菌的活細胞和死細胞。該方法將兩種核酸染料SYTO9和碘化丙啶(PI)混合使用，對細菌菌體進行染色，判斷細胞的活性，其原理是SYTO9可以穿過完整的細胞膜，進入菌體內與核酸結合而呈現綠色熒光。PI只能通過破損的細胞膜進入菌體結合核酸而呈現紅色熒光。若使用SYTO9和PI對細胞進行雙染，呈現綠色熒光的細胞則為有活性的細胞。隨后，將染色后的細菌經過流式細胞儀計數，從而實現定量檢測有活力的細菌菌體。但由于番茄潰瘍病菌菌體較小、細胞壁偏厚，使用現有的試劑盒并按照說明書提供的方法，并不能很好地區分有活力和失活的菌體。因此，在現有方法的基礎上通過研究和改進，篩選和調整染料和染色方法，獲得有活力番茄潰瘍病菌的計數方法，實現對該病原菌有活力菌體的快速計數，對在生產中控制番茄潰瘍病的傳播蔓延和發生危害具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種番茄潰瘍病菌有活力菌體的流式細胞術計數方法。

本發明提供一種檢測待測樣品中有活力菌體的方法，包括如下步驟：將待測樣品進行SYTO9染色，使用絕對計數管計數，得到待測樣品的總細胞數或總細胞濃度；將待測樣品進行PI染色，使用絕對計數管計數，得到待測樣品的死細胞數或死細胞濃度；用待測樣品的總細胞數減去待測樣品的死細胞數得到待測樣品中有活力菌體的細胞數，或，用待測樣品的總細胞濃度減去待測樣品的死細胞濃度得到待測樣品中有活力菌體的濃度。

上述方法中，所述使用絕對計數管計數是采用流式細胞儀結合絕對計數管進行計數的。

上述任一所述的方法中，所述流式細胞儀的FSC電壓模式為E00，SSC電壓為440V，放大模式為Log型，進樣速度為中速。

上述任一所述的方法中，所述將待測樣品進行SYTO9染色，使用絕對計數管計數時，流式細胞儀檢測時以FL1(530/30nm)作為檢測通道，電壓為640V。

上述任一所述的方法中，所述將待測樣品進行PI染色，使用絕對計數管計數時，流式細胞儀檢測時以FL2(585/42nm)作為檢測通道，電壓為625V。

上述任一所述的方法中，所述待測樣品中菌的濃度為10⁵-10⁷CFU/ml。

上述任一所述的方法中，所述SYTO9染色時SYTO9在所述待測樣品中的濃度為50μmol/L；

所述SYTO9染色時染色時間為20-40min，具體為30min。

上述任一所述的方法中，所述PI染色時PI在所述待測樣品中的濃度為150μmol/L；

所述PI染色時染色時間為30-60min，具體為50-60min，再具體為60min。

上述任一所述的方法中，所述菌為番茄潰瘍病菌。