[發明專利]一種降低發酵過程中林可霉素B組分的方法

在審

• 申請號: 201410393377.8
• 申請日: 2014-08-12
• 公開（公告）號: CN104164462A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 劉儉國;焦龍;唐慧慧;劉麗杰;李華;祝立新;李云霞;張衛民;王麗;劉慧敏;閆冬成;王九;劉新凱;田豐月;馬戰波
• 申請（專利權）人: 天方藥業有限公司
• 主分類號: C12P19/64
• 分類號: C12P19/64;C12R1/565
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新;郭麗娜

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技術領域????

????本發明屬于林可霉素生產技術領域，具體涉及一種降低發酵過程中林可霉素B組分的方法。

背景技術????

林可霉素是林可鏈霉菌（Streptomyces?lincolnenisis）產生的一種林可酰胺類抗生素，主要用于治療革蘭氏陽性菌引起的感染性疾病。林可霉素由4-丙基脯氨酸（PPL）和α-甲硫基林可酰胺（MTL）通過縮合反應生成去甲基林可霉，進一步甲基化而生成。

林可霉素及其半合成衍生物克林霉素是臨床上廣泛應用于抑制革蘭氏陽性菌的兩種林可酰胺類抗生素。我國林可霉素生產菌株發酵生產上卻一直面臨著有效組分林可霉素A產量不高和副產物林可霉素B含量偏高的問題。國外研究發現，發酵過程中直接添加作為前提的丙基脯氨酸可以提高林可霉素A的產量而相應減少林可霉素B的產量，但添加甲基化試劑是否會降低林可霉素B的產量則尚未有相關報道。

發明內容????

本發明的目的在于提供一種降低發酵過程中林可霉素B組分的方法。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種降低發酵過程中林可霉素B組分的方法，在發酵過程中加入甲基化試劑。

所述甲基化試劑為甲硫氨酸、葉酸、甜菜堿或氯化膽堿中的至少一種。

甲基化試劑的加入時機為發酵進行80-180h時。

進一步優選，甲基化試劑的加入時機為發酵進行100-120h時。

甲基化試劑的加入量為培養基質量的0.01-0.1%。

進一步優選，甲基化試劑的加入量為培養基質量的0.05-0.1%。

培養基的質量百分配方為：1.5%硫酸銨，0.03%磷酸二氫鉀，3%黃豆餅粉，2.0%玉米漿，1.0%碳酸鈣，8%葡萄糖，其余為水，pH7.0。

本發明經過多年的實驗摸索和篩選，最終確定了在發酵開始后的特定時間加入甲基化試劑，無論是單獨的一種甲基化試劑還是多種復合的甲基化試劑，均能夠顯著地降低林可霉素B組分，從而提高林可霉素A的產量，為林可霉素成本的降低和生產規模的擴大奠定了基礎。

具體實施方式??

以下結合具體實施例，對本發明作進一步的說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范圍。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆：實驗室手冊》（New?York:Cold?Spring?Harbor?Laboratory?PRESS,1989）中所述的條件或生產廠商推薦的條件進行。

在本發明的下述實施例中，使用的林可鏈霉菌（Streptomyces?lincolnenisis）已于2008年04月25日提交位于武漢大學的中國典型培養物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏號為CCTCC?M?208064。

除特別說明外，以下實施例中使用的%、‰均為重量比。

在本發明實施例中，培養基的質量百分配方為：1.5%硫酸銨，0.03%磷酸二氫鉀，3%黃豆餅粉，2.0%玉米漿，1.0%碳酸鈣，8%葡萄糖，其余為水，pH7.0。

在本發明的實施例中，采用高效液相色譜法測定林可霉素B組分的含量，中國藥典2005版二部－531。

實施例1

將培養好的林可鏈霉菌種子液按照10%接種量接入含有50mL培養基的500mL三角瓶中，培養溫度30℃，搖床轉速220r/min，發酵培養進行100h時添加甲硫氨酸（添加量為培養基的0.05%），7天后放瓶效價3900U/mL，林可霉素B組分含量1.4%。

對照例1：以上相同條件下，不添加甲硫氨酸時的對照效價為3760?U/mL，林可霉素B組分含量4.9%。

實施例2

將培養好的林可鏈霉菌種子液按照10%接種量接入含有50mL培養基的500mL三角瓶中，培養溫度30℃，搖床轉速220r/min，發酵培養進行120h時添加葉酸（添加量為培養基的0.03%），7天后放瓶效價4000U/mL，林可霉素B組分含量1.3%。

對照例2：以上相同條件下，不添加葉酸時的對照效價為3820?U/mL，林可霉素B組分含量5.0%。

實施例3