[發明專利]一種抗腫瘤藥物篩選細胞模型及其應用

有效

• 申請號: 201410381401.6
• 申請日: 2014-08-05
• 公開（公告）號: CN104130977B
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 趙旭東;楊東;代智;王路
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明動物研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司53115
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發明涉及一種抗腫瘤藥物篩選細胞模型及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

癌癥干細胞具有與組織干細胞類似的分子標記、自我更新和分化功能，在移植后能重現原癌癥的組織學、分子生物學等特征，耐常規放療和化療，是癌癥發生、復發和轉移的主要原因，因此癌癥干細胞正成為癌癥研究的重要領域和癌癥治療的主要靶標。但目前的抗腫瘤藥物主要用癌癥細胞系篩選獲得，缺乏針對腫瘤干細胞的藥物，也缺乏良好的基于腫瘤干細胞的藥物篩選模型。

膠質母細胞瘤是最常見的腦腫瘤，惡性程度極高。隨著癌癥研究的進展，大部分癌癥的治愈率和生存期都獲得了明顯改善，但膠質母細胞瘤病人的生存期在過去幾十年中沒有顯著改觀，平均僅約1年，迫切需要研發新的治療藥物。膠質母細胞瘤干細胞是最早確定的實體瘤干細胞之一，也是為數不多的在體外能穩定長期培養的腫瘤干細胞之一，為利用膠質母細胞瘤干細胞進行藥物篩選奠定了基礎。

藥物篩選模型是尋找和發現新藥物的重要條件之一。目前抗腫瘤藥物的篩選方法主要在包括體內和體外篩選方法，體內篩選方法成本高，操作難度大，不利于高通量的藥物篩選；體外篩選方法主要是在分子和細胞水平上實現的，具有材料用量少，作用機制明確，易用于大規模篩選等優點，是藥物篩選的主要方法。

藥物篩選細胞模型常用報告基因隨機插入建立穩定細胞株，控制外源標記基因表達的啟動子活性常受到整合位點附件基因組DNA的影響，因此標記基因的變化并不能完全反映內源基因的變化，影響藥效的評價。

綜上所述，有必要建立良好的基于膠質母細胞瘤干細胞的抗腫瘤藥物篩選模型。

發明內容：

本發明針對現有抗腫瘤藥物篩選技術存在的不足，提供一種簡便、快速、直接、經濟的抗腫瘤藥物篩選細胞模型及其建立方法和應用。

本發明的抗腫瘤藥物的細胞模型，是從膠質母細胞瘤中分離的，定點整合了報告基因的腫瘤干細胞，含有A－B－C－D結構的DNA構建物，其中：

A，D為膠質母細胞瘤干細胞分子標記基因啟動子及下游序列，B為報告基因序列，C為嘌呤霉素抗性基因puro序列；

膠質母細胞瘤干胞分子標記基因是但不限于Nestin基因；報告基因為但不限于綠色熒光蛋白基因EGFP，或YFP、RFP熒光蛋白，或熒光素酶luciferase。

本發明的抗腫瘤藥物篩選細胞模型的構建方法，運用同源重組技術，將報告基因綠色熒光蛋白EGFP定點整合至腫瘤干細胞分子標記基因Nestin啟動子下游，建立藥物的細胞毒性和分化誘導篩選平臺。

本發明的抗腫瘤藥物的細胞模型用于篩選抗腫瘤干細胞的細胞毒性和誘導分化的物質(如小分子化合物、多肽)。即：

將候選物質加入上述的培養細胞中，用高內涵設備或熒光顯微鏡檢測藥物組中報告基因的表達，并與對照組比較，所述對照組是不添加候選物質的上述細胞。如果測試組中報告基因表達細胞數低于對照組，就表明候選物質能夠抑制腫瘤干細胞增殖或誘導細胞凋亡；如果單個細胞中報告基因表達水平降低則說明候選物質能夠誘導腫瘤干細胞分化。

本發明的抗腫瘤藥物的細胞模型還能對篩選出的抗腫瘤干細胞物質進行進一步的細胞/動物實驗，以確定這些物質在抗腫瘤藥物研發中的前景。

本發明的有益效果在于：

1、避免了多拷貝轉基因所致的基因組不穩定性、轉基因插入會破壞內源基因、轉基因所用啟動子受插入位點兩側序列影響不能完全反映啟動子活性變化的不利影響，檢測結果將能正確反映藥物作用效果。

2、具有簡便、快速、直接、經濟的優點。

附圖說明：

圖1是將EGFP定點整合至nestin啟動子下游的打靶示意圖。

圖2-a和圖2-b顯示腺病毒感染腫瘤干細胞后熒光觀察結果。

圖3-a和圖3-b顯示腺病毒感染腫瘤干細胞后PCR檢測陽性克隆細胞。

具體實施方式：

下面結合附圖和實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體的實驗方法，通常按照常規條件如分子克隆實驗指南(sambrook,J.)中所述的方法，或按照實驗所用試劑或儀器說明書建議方法。

一、構建物及載體

所述構建物從5’端到3’端依次含有nestin啟動子序列，報告基因序列，內部核糖體進入位點序列(IRES)或者自剪切2A肽序列,嘌呤霉素抗性基因序列(puro)，轉錄終止信號序列(polyA)和nestin啟動子下游序列。