[發明專利]草甘膦抗性提高的葡萄EPSPS突變體的制備及其應用

有效

• 申請號: 201410371996.7
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104232600B
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發明（設計）人: 田永生;許晶;姚泉洪;彭日荷;趙偉;付曉燕;王麗娟;韓紅娟;王波
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/82
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

本發明公開了一種采用DNA分子重排（DNA Shuffling）技術獲得了草甘膦抗性增強的來源于葡萄的EPSP合酶多位點突變體及其編碼基因與應用。所述突變體含有7個突變位點，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼的堿基序列如SEQ ID No.2所示。試驗表明，本發明的來源于葡萄的EPSP合酶多位點突變體及其編碼的基因，同時具有較高的草甘膦抗性和較強的與PEP親和性，這些特性將為該基因用于抗草甘膦轉基因作物的培育提供了可能。

技術領域

本發明屬微生物領域，涉及一種來源于葡萄(Vitis vinifera)的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶/EPSPS)多位點突變體及其編碼基因與應用，具體涉及一種利用DNA分子重排(DNA Shuffling)和功能互補法對來源于葡萄EPSP合酶基因進行改造獲得多位點突變體，然后將其編碼的基因應用于草甘膦的抗性研究以及水稻轉化、轉基因作物培育中。

背景技術

莽草酸途徑是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途徑。EPSP合酶是莽草酸途徑的關鍵酶，催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate，EPSP)和無機磷。除草劑草甘膦是PEP的結構類似物，能與PEP競爭性抑制EPSPS的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合成，最終導致植物死亡。迄今為止，成功用于商業化的抗草甘膦轉基因作物的基因只有II型的農桿菌CP4的EPSPS基因。然而由于該基因來源于細菌，因而容易引起普通消費者的心理顧忌。最近有學者報道了來源于可食性植物的EPSPS基因在轉基因作物中表現出了良好的草甘膦抗性(Plant Physiol 140:184-195)，這就為發展抗草甘膦轉基因作物提供了一種新的途徑即以植物源的EPSPS基因來為基礎來發展抗草甘膦轉基因作物。但是來源于植物的野生型EPSPS基因往往對草甘膦很敏感，因而不能直接用于轉基因作物的培育。這就需要通過基因工程手段對其進行改造，從而獲得新型的來源于植物的功能良好的可用于轉基因作物培育的新型基因。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種來源于葡萄的EPSP合酶多位點突變體及其編碼基因與應用。通過采用DNA分子重排(DNA Shuffling)獲得該EPSP合酶多位點突變體文庫，然后利用大腸桿菌aroA突變株(ER2799)的功能互補對來源于葡萄的EPSP合酶突變體文庫進行篩選，獲得了一個含有7個氨基酸突變的多位點突變體，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。經試驗驗證，該突變體不但在大腸桿菌中表現出顯著地高草甘膦抗性，而且在轉基因植物中也表現出了穩定的草甘膦抗性。

為了達到以上目的，本發明采用以下技術方案來實現：

首先，申請人在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)輸入5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase and Vitis vinifera,得到序列號為NM_001281247的編碼葡萄5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因的mRNA序列。根據此序列設計一對PCR引物(VvEPSPSZ和VvEPSPSF)，以本試驗保存的巨峰葡萄cDNA文庫(西北植物學報,2009,29:1723-1729)為模板，RT-PCR擴增獲得葡萄EPSP合酶基因(VvEPSPS)的全長cDNA序列。