[發明專利]基于TMRM的細胞靜息膜電位和鈉鉀離子通透性比值檢測方法

有效

• 申請號: 201410366655.0
• 申請日: 2014-07-29
• 公開（公告）號: CN104101589A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 吳澤志;張利光;林雨;鐘冬火
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

1.基于TMRM的細胞靜息膜電位檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

A.TMRM熒光強度與濃度的關系標定

將TMRM配制成一系列梯度濃度的溶液，對上述溶液分別進行熒光強度檢測，將測得的TMRM熒光強度與對應的TMRM濃度用式(1)進行擬合：

F＝k[TMRM⁺]??(1)

其中F為TMRM熒光強度，[TMRM⁺]為TMRM濃度；求得標定系數k；

B.細胞核區TMRM的非特異性吸附標定

先用鉀、鈉離子通透劑處理細胞使細胞完全去極化，則細胞內外游離TMRM濃度相等，再用一系列梯度濃度的TMRM溶液分別孵育細胞，測定細胞核區TMRM熒光強度，通過式(1)計算出細胞核區TMRM總濃度，再通過式(2)計算出細胞核區非特異性結合的TMRM濃度：

[TMRMi+]=[TMRMB+]+[TMRMif+]---(2)]]>

其中[TMRM_i⁺]為細胞核區TMRM總濃度，[TMRM_B⁺]為細胞核區非特異性結合的TMRM濃度；為細胞核區游離TMRM濃度，其值與胞外游離TMRM濃度相等；

然后，將計算出的細胞核區非特異性結合的TMRM濃度與細胞核區游離TMRM濃度用一配基兩個獨立結合位點的模型即式(3)進行擬合：

[TMRMB+]=[TMRMBmax1+][TMRMif+]KD1+[TMRMif+]+[TMRMBmax2+][TMRMif+]KD2+[TMRMif+]---(3)]]>

其中[TMRM⁺_Bmax1]和[TMRM⁺_Bmax2]分別為兩個獨立結合位點中最大非特異性結合的TMRM濃度，K_D1和K_D2分別為TMRM與兩個獨立結合位點的解離常數；求得[TMRM⁺_Bmax1]、[TMRM⁺_Bmax2]、K_D1和K_D2；

C.基于TMRM的細胞靜息膜電位檢測

用一定濃度的TMRM溶液孵育細胞，測定細胞核區的TMRM熒光強度，通過式(1)計算出細胞核區TMRM總濃度，將式(3)代入式(2)求解得到再通過式(4)計算出細胞靜息膜電位：

Vm=-60log10[TMRMif+][TMRMo+]---(4)]]>

其中V_m為細胞靜息膜電位，[TMRM_o⁺]為細胞外TMRM濃度。