[發明專利]肺炎鏈球菌自溶素小片斷基因表達蛋白、制備方法及用途

無效

• 申請號: 201410352085.X
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN104152467A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 羅紅;殷素嵐;鄒琴;孫文平;楊光;謝興鳳;周杰;呂明睿;劉科芳
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/315;C12N15/66;A61K38/16;A61P31/04
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術領域

本發明涉及一種肺炎鏈球菌自溶素小片斷基因表達蛋白、制備方法及用途，尤其是一種制備簡單、成本低、副作用小的肺炎鏈球菌ATCC49619株自溶素（N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，LytA）小片段基因的原核表達蛋白、制備方法及在制備抗菌藥物中的應用。

背景技術

肺炎鏈球菌自溶素（N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，LytA）是肺炎鏈球菌細胞壁降解酶之一，全段蛋白約為56?kD。目前，LytA全蛋白主要應用于肺炎鏈球菌的疫苗靶點以及血清學診斷的抗原，而要獲得LytA全蛋白，通常需要經過如下兩個步驟：首先通過原核表達、鎳柱純化的方式得到具有組氨酸接頭并結合有硫氧還原蛋白的融合蛋白；然后再切除硫氧還原蛋白及組氨酸接頭。制備LytA全蛋白不僅操作復雜、成本高，而且LytA全蛋白中只有部分功能團發揮作用，其余部分有可能引起機體的副反應或者增加空間位阻。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種制備簡單、成本低、副作用小的肺炎鏈球菌ATCC49619株自溶素（N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，LytA）小片段基因的原核表達蛋白、制備方法及在制備抗菌藥物中的應用。

本發明的技術解決方案是：一種肺炎鏈球菌自溶素小片斷基因表達蛋白，其特征在于如SEQ?ID?NO：5?所示的氨基酸序列。

一種上述肺炎鏈球菌自溶素小片斷基因表達蛋白的制備方法，其特征在于按如下步驟進行：

a.?提取肺炎鏈球菌（ATCC49619）基因組DNA；

b.?以得到的DNA為模板，以具有BamHI和HindIII兩個酶切位點的PCR反應引物進行PCR反應；所述PCR反應引物序列如下：

上游引物BamHI：

5′-GGGGGATCCATGGAAATTAATGTGAGT-3′

下游引物HindIII：

5′-GGGAAGCTTTTTTACTGTAATCAAGCCATC-3′，

c.?將切膠回收的PCR反應產物與克隆載體相接，構建克隆質粒；

d.?分別用BamHI和HindIII雙酶切所構建的克隆質粒，切膠回收500bp小片段，用連接酶與表達載體連接，再轉化到感受態細胞，挑取單個克隆培養后，構建重組表達質粒；

e.?將所構建的重組表達質粒轉化到感受態細胞，提取陽性克隆并將所得陽性克隆進行IPTG誘導表達；

f.?4℃離心收集經IPTG誘導表達的菌體，加入裂解液超聲破碎，4℃離心收集上清，用透析袋等電點洗脫法回收純化蛋白。

一種上述肺炎鏈球菌自溶素小片斷基因表達蛋白的用途，其特征在于在制備抗菌藥物中的應用

GeneBank中沒有公布肺炎鏈球菌菌株（ATCC49619）自溶素序列，相比于目前基因庫中公布的其他肺炎鏈球菌菌株序列，肺炎鏈球菌菌株（ATCC49619）自溶素序列中新出現個BamHI的酶切位點。本發明以GenBank中肺炎鏈球菌M66菌株自溶素基因全序列（FN549899.1）設計上下游引物，以肺炎鏈球菌菌株（ATCC49619）DNA為模板進行PCR反應，擴增自溶素序列，以PCR反應產物構建的克隆載體用常規的兩種酶BamHI和HindIII雙酶切后，目的基因出現兩個小片度，以其中的約500bp小片段構建重組表達載體，經IPTG誘導后，采用等電點洗脫法可直接獲取了一個新的小片段基因蛋白。PAGE電泳顯示該小片段基因蛋白分子量約為20?kD，結合序列測定及質譜測定結果，證明該小片段基因蛋白不含有現有全蛋白表達所帶的硫氧還原蛋白，只需等電點洗脫純化，無需進一步切除硫氧還原蛋白及組氨酸接頭，操作簡單、成本低。如以合成多肽的方式來獲得這段蛋白，則因小片段多肽氨基酸數量少，合成費用（合成多肽是以氨基酸數量計費）也遠低于全片段蛋白。實驗表明本發明的小片斷基因蛋白對肺炎鏈球菌株發揮了溶菌效應，可與全蛋白具有相同的抑菌效果，避免功能團其余部分有可能引起機體的副反應或者增加空間位阻。

附圖說明

圖1是本發明實施例PCR反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。

圖2、圖3是本發明實施例重組克隆質粒PGM-T/lytA測序結果圖。

圖4是本發明實施例重組克隆質粒PGM-T/lytA雙酶切后經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。