[發明專利]安徽麝微衛星位點、引物及其應用

有效

• 申請號: 201410345129.6
• 申請日: 2014-07-21
• 公開（公告）號: CN104087583A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發明（設計）人: 張保衛;丁玲;王慧;潘濤
• 申請（專利權）人: 張保衛
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術，尤其涉及的是安徽麝微衛星位點、引物及其應用。

背景技術

安徽麝隸屬于偶蹄目(Artiodactyla)、反芻亞目(Ruminantia)、有角下目(Pecora)、麝科(Moschidae)，是古北界特有哺乳動物。僅分布在安徽、河南、湖北三省交界的大別山，是華東地區珍貴的野生動物資源。目前，種群數量總計在500-600只左右。分子生物信息為建立改物種保護單元提供了一定的理論依據。而該方面的研究上處于空白。因此，展開安徽麝的遺傳學研究已經可不容緩。

目前安徽麝種群數量稀少，在野外調查中較難發現，導致樣品的采集十分艱難，而目前最為合適的非損傷采樣方法是采集糞便。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供安徽麝微衛星位點、引物及其應用。本發明是首次提供安徽麝的微衛星位點及引物，并且利用這些位點對采集到的糞便樣品進行遺傳學鑒定和個體識別。這些位點在對安徽麝的保護遺傳學研究、種質資源調查、個體識別和輔助育種中起到重要作用。

本發明的技術方案如下：

安徽麝微衛星位點，包括9個穩定的多態性微衛星位點，其序列分別如SEQ?ID?NO：1-SEQ?ID?NO：9所示。

所述的安徽麝微衛星位點的引物，其序列分別如SEQ?ID?NO：10-SEQ?ID?NO：27所示。

所述的安徽麝微衛星位點或者所述的引物的應用，包括分子生態學研究，譜系分析，種質資源調查，輔助育種和個體識別，所述9個穩定的多態性微衛星位點組合使用，或者其對應的引物組合使用。

應用上述引物，對7個個體的基因分型數據顯示，等位基因數為0-4，期望雜合度He為0-0.779，觀測雜合度Ho為0-0.714.除了位點MaI75外，其他均表現出多態性，達到了個體識別的要求。

附圖說明

圖1?AFLP擴增結果凝膠電泳檢測圖；M：Trans?2K?Plus?II?DNA?Marker；L1-L2：AFLP擴增結果；Y：空白對照；

圖2安徽麝糞便DNA提取結果凝膠電泳圖；M：Trans?2K?DNA?Marker；L1-L7：糞便DNA抽提結果；

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。

1、建庫DNA抽提

由于建庫篩選微衛星位點需要高質量的模板，所以我們剪取安徽麝肌肉組織(來自林業局收繳的偷獵樣品)，提取DNA作為微衛星富集文庫的模板。基因組DNA的抽提采用SDS/蛋白酶K裂解、酚-氯仿抽提途徑(Sambrook?et?al.，1999)。

2、安徽麝微衛星富集文庫的構建

利用提取基因組DNA，采用AFLP快速分離法(Fast?Isolation?by?AFLP?of?Sequences?Containing?repeats，FIASCO)來構建微衛星富集文庫，具體過程如下：取基因組DNA?250ng左右，使用MseI消化，同時與MseI的AFLP受體接頭(5’-TAC?TCA?GGA?CTC?AT-3’/5’-GAC?GAT?GAG?TCC?TGA?G-3’)進行連接。將消化產物稀釋十倍以后，用AFLP受體特異的引物(5’-GAT?GAG?TCC?TGA?GTAAN-3’，簡稱MseI-N)做PCR擴增。擴增產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳30min后為大于200bp的彌散帶(如圖1)。

使用探針(AC)₁₂或者(AG)₁₂與酶切連接液PCR擴增片段進行雜交后，使用磁珠進行吸附洗脫，即可獲得所需的單鏈微衛星重復序列。以捕獲的DNA為模板，以MseI-N為引物進行雙鏈DNA恢復。PCR反應體積為50μL，反應體系組成為：dNTP?5μL，Buffer?5μL，rTaq?0.5μL，MseI-N?Primer?2μL，磁珠洗脫液5μL。PCR的循環設置為：95℃預變性5min；95℃變性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸45sec，進行5個循環；進行另外92℃變性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸45sec的30個循環，72℃延伸10min。