[發明專利]一種利用新MVA途徑合成異戊二烯的方法及其相應重組細胞和應用

有效

• 申請號: 201410334650.X
• 申請日: 2014-07-15
• 公開（公告）號: CN104164457A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 楊建明;易曉華;王曉璐;聶慶娟
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12P5/02
• 分類號: C12P5/02;C12N1/21;C12N15/70;C12N1/19;C12R1/19;C12R1/125;C12R1/865
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

1.一種利用新MVA途徑合成異戊二烯的方法，其特征在于它包括以下步驟：

（1）依次構建分別含有mvaS基因、mvaE基因、OleT_JE?基因和OhyA_EM基因的載體pGH-mvaS、pGH-mvaE、pGH-OleT_JE和pGH-OhyA_EM；

（2）構建載體pACY-mvaE-mvaS；將所述載體pGH-OleT_JE與載體pCOLADuet-1分別用BamHI?和SacI進行雙酶切，酶切后的載體與OleT_JE基因片段按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒pCOLA-OleT_JE；

擴增基因OleT_JE片段，將載體pBAD18與基因OleT_JE片段分別用NheI和SacI進行雙酶切，酶切后的載體與兩端帶有相應酶切位點的OleT_JE基因片段按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒pBAD-OleT_JE；

擴增基因OhyA_EM片段，將pCOLADuet-1載體與基因OhyA_EM片段分別用BamHI?和?HindIII進行雙酶切，酶切后的載體與OhyA_EM基因片段按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒pCOLA-OhyA_EM；

所述pGH-OhyA_EM與所述pCOLA-OleT_JE分別用BglII?和XhoI進行雙酶切，酶切后的載體pCOLA-OleT_JE與外源基因片段OhyA_EM按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒pCOLA-OleT_JE-OhyA_EM；

所述pCOLA-OleT_JE-OhyA_EM和pET-28a(+)載體分別用BamHI?和XhoI酶切，酶切后載體和基因片段OleT_JE-OhyA_EM連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒pET28-OleT_JE-OhyA_EM；

擴增OhyA_EM片段，將載體pBAD-OleT_JE與基因OhyA_EM片段分別用SalI和?HindIII進行雙酶切，酶切后載體與兩端帶有相應酶切位點的OhyA_EM基因片段按摩爾比1:5的比例連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選的陽性克隆為重組質粒pBAD-OleT_JE?-OhyA_EM；

（3）將載體pACY-mvaE-mvaS分別和重組質粒pCOLA-OleT_JE-OhyA_EM、重組質粒pET28-OleT_JE-OhyA_EM和重組質粒pBAD-OleT_JE?-OhyA_EM共同轉化大腸桿菌，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固體平板，分別獲得陽性克隆YJM32工程大腸桿菌、YJM33工程大腸桿菌和YJM34工程大腸桿菌；

（4）活化后的上述工程大腸桿菌接種到含有卡那霉素、氯霉素或氨芐霉素的LB液體培養液中培養，當OD_600nm為0.6-0.8時，在菌液中加入誘導劑至終濃度0.5?mmol·L^-1，然后轉入在30℃下繼續誘導培養24h，發酵獲得異戊二烯。