[發明專利]一種酸棗不定芽途徑誘導多倍體的方法

有效

• 申請號: 201410334141.7
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104082146A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發明（設計）人: 李穎岳;王巖;龐曉明;王歡;康亞璇
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N5/04
• 代理公司: 北京市廣友專利事務所有限責任公司 11237
• 代理人: 張仲波

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是指一種酸棗不定芽途徑誘導多倍體的方法。

背景技術

棗(Zizyphus.jujuba?Mill.)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Zizyphus.Mill.)植物，是原產于中國的特色優勢經濟樹種，其味道鮮美，果形美觀，富含人體所需的多種氨基酸和維生素，還含有多種多糖、微量元素及抗癌物質環磷酸腺苷等藥用成分，是藥食兩用滋補品。

酸棗(Ziziphus?spinosus?Hu.)原產中國華北，多野生，耐干旱、貧瘠，在山區開發中曾發揮重要作用。酸棗花期長，是良好的蜜源植物，種仁飽滿可入藥。酸棗作為食品，營養價值很高，含有鉀、鈉、鐵、鋅、磷、硒等多種微量元素；更重要的是酸棗中含有大量的維生素C，其含量是普通紅棗的2～3倍、柑橘的20～30倍，在人體中利用率可達86.3％。此外，近年來果汁、果醋等天然養生食品深受廣大消費者喜愛，酸棗作為生產原材料，其棗果品質的增加可以大幅提高生產效率，減少生產成本。

酸棗的多倍體研究已有一些報道，但多采用田間愈傷組織途徑或材料為叢芽、莖段的離體誘導途徑，這些途徑通常會形成的嵌合體，很難得到純合四倍體。本發明以酸棗無菌苗的幼嫩葉片作為試驗材料，采用直接再生不定芽途徑進行多倍體的誘導，從而有效的避免嵌合體的出現。此外，對于棗樹葉片離體多倍體誘導最佳處理時期的相關研究還未見報道，本發明采用兩步培養法，在第一步預(暗)培養中首次找到秋水仙堿最佳處理時期，進而可以提高誘變效率，以期短時間內獲得大量的多倍體材料，對棗樹的遺傳改良具有重要價值。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供酸棗不定芽途徑誘導多倍體中秋水仙堿的最佳處理時期、適宜濃度和處理時間，以解決現有方法很難得到純合四倍體的問題。

為解決上述技術問題，本發明實施例提供一種酸棗不定芽途徑誘導多倍體的方法，包括如下步驟：啟動培養，剪取酸棗無菌苗的幼嫩葉片，刻傷后接種到不定芽啟動培養基一上進行9～11d預(暗)培養；誘導培養，將葉片轉至含有40～80mg/L秋水仙堿的液體培養基中進行多倍體誘導培養，在黑暗條件下100rmp搖床震蕩培養2～3d后轉入不定芽啟動培養基一上繼續暗培養8～10d；伸長培養，預(暗)培養結束后，將葉片轉接到不定芽伸長培養基二上，移至光下培養25～35d；壯苗培育，將葉片再生出的不定芽從葉片上剝離，轉接到含有植物生長調節劑的MS壯苗培養基中，培養18～20d；幼葉檢測，待不定芽生長健壯后，取幼嫩葉片，進行多倍體檢測。

其中，所述不定芽啟動培養基一包括改良WPM基本培養基和包含1.0mg/L的噻苯隆和0.3mg/L的吲哚-3-丁酸的植物生長調節劑；所述不定芽伸長培養基二包括改良WPM基本培養基和包含0.1mg/L的吲哚-3-乙酸和0.5mg/L的赤霉素的植物生長調節劑。

其中，所述改良WPM基本培養基含蔗糖30g/L，ph＝5.8～6.2，配方為：

其中，所述MS壯苗培養基含蔗糖30g/L，ph＝5.8-6.2，配方為：

其中，所述壯苗培養基中的植物生長調節劑為1.0mg/L的6-芐氨基腺嘌呤和0.4mg/L的吲哚丁酸。

其中，所述幼嫩葉片為酸棗無菌苗植株形態學上端至下端的第3-5枚的三枚葉片；所述葉片刻傷方法為沿中脈垂直方向橫切2～3個傷口，切斷主脈但不切斷葉片；所述接種方式為近軸端接觸培養基。

其中，所述誘導培養所用液體培養基為不加入瓊脂的不定芽啟動培養基一，所述秋水仙堿的濃度為40～80mg/L。

其中，所述伸長培養階段采用人工控制的培養條件，所述人工控制的培養條件中光照強度為19000x～21002x，光照時間12～16h/d，溫度23～27℃。

其中，所述多倍體檢測方法為流式細胞儀法，所用裂解液為改良WPB裂解液，所用染液為10ug/L的DAPI染液。

其中，所述改良WPB裂解液ph＝7.2～7.8，配方為：