[發明專利]一種檢測羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條

無效

• 申請號: 201410327203.1
• 申請日: 2014-07-10
• 公開（公告）號: CN104165989A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 王一東;張強
• 申請（專利權）人: 長春理工大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙) 22211
• 代理人: 紀尚

技術領域

本發明屬于生化技術領域，涉及一種生產食用菌檢測的改進。?

背景技術

羊肚菌是一種珍稀的食用菌，其以美味著稱。近年來的研究還發現其具有豐富的保健價值。由于人工栽培技術還不成熟，產品基本靠野生資源的采集，價格居高不下。實現羊肚菌的人工栽培具有巨大的商業價值。我們知道，在羊肚菌人工栽培時，如果栽培的菌種不是羊肚菌或是在栽培過程中培養基被雜菌污染，這種情況是栽培不出羊肚菌的。在羊肚菌的人工栽培實踐過程中，從菌種培養到子實體（菇體）的採收大約需要4至6個月時間，一般情況下，只有出菇才能證明接種的菌種是羊肚菌菌種，這也是傳統的形態學檢定方法，這種鑒定方法的好處是直接、客觀；最大的缺陷是周期過長，而且由于羊肚菌栽培、出菇受多種因素影響而不易出菇，這種方法羊對肚菌的人工栽培過程的早期及期中檢測上受到限制。另外一種檢定羊肚菌的方法是在實驗室條件下的提取羊肚菌的DNA，通過核酸序列檢測比對來鑒定，該方法的優勢是精準，缺點是需要專業的檢測實驗室，檢測周期長（數天），費用昂貴。?

參考文獻：?

???????（1）??孟盟，曹池，陳漢忠，等.水牛伊氏錐蟲病免疫膠體金試紙條的研制及初步應用[J].畜牧獸醫學報，2011,42（7）：988-933.

???????（2）王一東,劉建.?一株抗羊肚菌單克隆抗體及其制備方法:中國,200910218152.8[P].2010-06-09.

???????（3）馬帥，陳華林，王雅文，等.免疫酶染色法對羊肚菌菌絲特異性靶位的初步定位與分析[J].菌物研究，2014,12（2）：115-118.

發明內容

本發明的目的是：提供一種檢測羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條，它可簡便、快捷、準確地檢測羊肚菌。?

本發明的技術方案是：在塑料襯板上依次貼附有樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水紙，將膠體金標記的抗羊肚菌抗體噴涂或浸泡金標墊上，將用PBS緩沖液稀釋的山羊抗鼠IgG包被在質控線上，將用PBS緩沖液稀釋的抗羊肚菌兔血清多克隆抗體包被在檢測線上，在質控線和檢測線外表包被有NC膜。?

山羊抗鼠IgG用PBS緩沖液做1/100、1/200、1/500、1/1000和1/2000稀釋包被質控線。?

將濃度為4.22?ug/ul的抗羊肚菌兔血清多克隆抗體用PBS緩沖液做1、2、3、4、5和6倍稀釋包被檢測線。?

本發明的制備方法是：?

（1）膠體金標記抗羊肚菌抗體（單克隆抗體、多克隆抗體）的制備

????經硫酸銨沉淀法純化的單克隆抗體（C6A8細胞株）及兔多克隆抗體的蛋白濃度分別為2.91?ug/ul，4.22?ug/ul。C6A8單抗的效價為1：1280，兔血清的效價:1：2560。膠體金溶液pH在8.5左右，C6A8單抗加入膠體金溶液中使其終濃度為0.58?ug/ml時，可以將膠體金較好的標記在抗羊肚菌單克隆抗體C6A8上。將膠體金標記的抗羊肚菌抗體或噴涂或浸泡金標墊，將金標墊37℃1h，烘干，備用。

（2）質控線抗體與檢測線抗體包被濃度

檢測線包被抗體（使用的是純化的兔抗羊肚菌多抗）蛋白濃度為：62.1ug/ml,質控線包被抗體（山羊抗鼠IgG（H+L））蛋白濃度為：6.4ug/ml。將上述試劑用噴或涂或點樣的方式包被到硝酸纖維素膜（NC膜）對應位置上，37℃1h，烘干。將包被好的硝酸纖維膜浸泡于1%的牛血清白蛋白（BSA）中封閉，37℃1h，烘干。備用。

（3）試紙條的裝配及試紙條檢驗結果判定。

?如圖1所示，依次將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水紙貼于塑料襯板上，切成0.4cm寬的長條；

吸取適量經過研磨處理的待檢樣品，滴加到試紙條的樣品墊上，可見樣品通過層析作用向前移行，在移行過程中NC膜上會出現肉眼町見的紅色條帶，于加樣后l0?min觀察結果，T線和C線都顯色．結果為陽性；C線顯色，T線不顯色，結果為陰性；若C線不顯色，則試紙條無效。

本發明的有益效果是：具有檢測周期短（1小時內出結果）；操作簡便，不需要專業人員及儀器設備檢測；成本低（每個檢樣花費需要幾元至十幾元）；定性檢測結果準確。本方法可解決羊肚菌人工栽培中菌種是否是羊肚菌菌種，以及栽培后培養料中生長的菌絲是否是羊肚菌菌絲的監測，可以減少損失。?

附圖說明

圖1是本發明結構圖。?

具體實施方式

下面結合附圖對本發明作進一步描述：?

實施例1