[發明專利]一種黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法

在審

• 申請號: 201410322963.3
• 申請日: 2014-07-08
• 公開（公告）號: CN104062349A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 李力;何敏;徐永莉;臧寧;周怡;張月云;谷穎樂;趙成堅;黃勇
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區藥用植物園
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;G01N1/28
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 靳浩

技術領域

本發明涉及一種從蛋白質譜水平對黑斑蛤蚧與紅斑蛤蚧進行分析，找到差異，通過現代分析方法對蛤蚧這種動物性來源的中藥的假冒品、偽劣品、近緣品等進行鑒定的方法，特別涉及一種黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法。

背景技術

中藥蛤蚧是壁虎科動物蛤蚧的干燥體，其味咸、性平，具有補肺益腎、納氣定喘、助陽益精的功效，被用于制備定喘藥物。傳統上用于治療哮喘的入藥蛤蚧為產于我國的黑斑蛤蚧(也稱黑斑蛤蚧)，隨著人們生活水平的提高以及哮喘發病率連續20多年呈上升趨勢，近年來黑斑蛤蚧逐漸的減少，大量來自東南亞的紅斑蛤蚧占據藥品市場，紅斑蛤蚧的藥效遠遠不如黑斑蛤蚧。紅斑蛤蚧與黑斑蛤蚧在形態上非常接近，干燥體完全無法用肉眼區分，很難從藥材本身特別是制成粉末之后的藥材來確定動物的品種來源和質量，故目前無規范性的檢測方法。

發明內容

為此，本發明提供一種黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法，利用表面增強激光解析/電離飛行時間質譜技術(SELDI-TOF-MS)進行蛤蚧品種的鑒定，解決了中藥藥材的規范性檢測的問題。需要說明的是，本發明的申請人進行研究的前提并非認為蛋白為蛤蚧有效成分，僅基于蛤蚧為整體入藥的動物，拋開其有效成分，單獨從中藥材個體真偽鑒定而言。

本發明提供的技術方案為：

一種黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法，包括如下步驟：

步驟一、分別提取多只黑斑蛤蚧和多只紅斑蛤蚧的蛋白質樣品，之后將蛋白質樣品結合于芯片上制成蛋白質芯片，利用飛行時間質譜儀閱讀所述蛋白質芯片，得到黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的蛋白質質譜圖，分析篩選出質譜峰的峰值存在顯著差異的17個蛋白，計算出17個蛋白用于鑒定黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的峰值，并利用17個蛋白及計算出的鑒定用的峰值建立決策樹模型；

步驟二、利用與步驟一中相同的方法得到待鑒定蛤蚧的蛋白質質譜圖，利用決策樹模型比較待鑒定蛤蚧的17個蛋白的質譜峰的峰值，判斷出待鑒定蛤蚧的品種。

優選的是，所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法中，

所述的步驟一中，利用17個蛋白中的四個蛋白質及對應地計算出的鑒定用的峰值建立決策樹模型；

所述步驟二中，利用決策樹模型比較待鑒定蛤蚧的所述四個蛋白質的質譜峰的峰值判斷出待鑒定蛤蚧的品種；

其中，所述四個蛋白質的質荷比分別為6683.75m/z、1483.00m/z、25558.0m/z、和1191.71m/z，所述四個蛋白質的四種。

優選的是，所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法中，

所述步驟一中，17個蛋白中的兩個蛋白質及對應地計算出的鑒定用的峰值建立決策樹模型；

所述步驟二中，利用決策樹模型比較待鑒定蛤蚧的所述兩個蛋白質的質譜峰的峰值判斷出待鑒定蛤蚧的品種；

其中，所述兩個蛋白質的質荷比分別為6683.75m/z和25558.0m/z。

優選的是，所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法中，所述決策樹模型中以質荷比為6683.75m/z的蛋白質的用于鑒定黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的質譜峰的峰值為根結點，以其他蛋白質的用于鑒定黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的質譜峰的峰值為枝結點。

優選的是，所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法中，蛋白質的用于鑒定黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的質譜峰的峰值為一確定數值或一數值范圍。

優選的是，所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法中，所述步驟一中，所用的芯片為CM10芯片，

將預濕的CM10芯片、100μg蛋白質樣品和體積為所述100μg蛋白質樣品2倍的CM10芯片的結合緩沖液混勻，震蕩1h后除去液體，使用CM10芯片清洗緩沖液清洗CM10芯片3次，再使用1mM HEPES清洗1次，待干后，即制成蛋白質芯片。

優選的是，所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法中，制成蛋白質芯片后，還包括：在所述蛋白質芯片的每個加樣孔分兩次加入飽和SPA溶液，每次加0.5μL，之后利用飛行時間質譜儀閱讀所述蛋白質芯片。

優選的是，所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法中，所述步驟一中，飛行時間質譜儀閱讀蛋白質芯片的條件設置為：

激光強度：250；

檢測敏感度：9；

分子量優化范圍：1000-50000m/z，最佳聚焦中心為8000m/z；

數據采集參數范圍20～80，收集點數為100次。

優選的是，所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法中，所述步驟一中，利用30只黑斑蛤蚧和30只紅斑蛤蚧提取蛋白質樣品，