[發明專利]一種黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法

在審

• 申請號: 201410322963.3
• 申請日: 2014-07-08
• 公開（公告）號: CN104062349A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 李力;何敏;徐永莉;臧寧;周怡;張月云;谷穎樂;趙成堅;黃勇
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區藥用植物園
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;G01N1/28
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 靳浩

1.一種黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、分別提取多只黑斑蛤蚧和多只紅斑蛤蚧的蛋白質樣品，之后將蛋白質樣品結合于芯片上制成蛋白質芯片，利用飛行時間質譜儀閱讀所述蛋白質芯片，得到黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的蛋白質質譜圖，分析篩選出質譜峰的峰值存在顯著差異的17個蛋白，計算出17個蛋白用于鑒定黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的峰值，并利用17個蛋白及計算出的鑒定用的峰值建立決策樹模型；

以及，

步驟二、利用與步驟一中相同的方法得到待鑒定蛤蚧的蛋白質質譜圖，利用決策樹模型比較待鑒定蛤蚧的17個蛋白的質譜峰的峰值，判斷出待鑒定蛤蚧的品種。

2.如權利要求1所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法，其特征在于，

所述步驟一中，利用17個蛋白中的四個蛋白質及對應地計算出的鑒定用的峰值建立決策樹模型；

所述步驟二中，利用決策樹模型比較待鑒定蛤蚧的所述四個蛋白質的質譜峰的峰值判斷出待鑒定蛤蚧的品種；

其中，所述四個蛋白質的質荷比分別為6683.75m/z、1483.00m/z、25558.0m/z、和1191.71m/z，所述四個蛋白質的四種。

3.如權利要求1所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法，其特征在于，

所述步驟一中，17個蛋白中的兩個蛋白質及對應地計算出的鑒定用的峰值建立決策樹模型；

所述步驟二中，利用決策樹模型比較待鑒定蛤蚧的所述兩個蛋白質的質譜峰的峰值判斷出待鑒定蛤蚧的品種；

其中，所述兩個蛋白質的質荷比分別為6683.75m/z和25558.0m/z。

4.如權利要求1～3任一項所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法，其特征在于，所述決策樹模型中以質荷比為6683.75m/z的蛋白質的用于鑒定黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的質譜峰的峰值為根結點，以其他蛋白質的用于鑒定黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的質譜峰的峰值為枝結點。

5.如權利要求4所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法，其特征在于，蛋白質的用于鑒定黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的質譜峰的峰值為一確定數值或一數值范圍。

6.如權利要求5所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法，其特征在于，所述步驟一中，所用的芯片為CM10芯片，

將預濕的CM10芯片、100μg蛋白質樣品和體積為所述100μg蛋白質樣品2倍的CM10芯片的結合緩沖液混勻，震蕩1h后除去液體，使用CM10芯片清洗緩沖液清洗CM10芯片3次，再使用1mM HEPES清洗1次，待干后，即制成蛋白質芯片。

7.如權利要求1或5任一項所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法，其特征在于，制成蛋白質芯片后，還包括：在所述蛋白質芯片的每個加樣孔分兩次加入飽和SPA溶液，每次加0.5μL，之后利用飛行時間質譜儀閱讀所述蛋白質芯片。

8.如權利要求1所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法，其特征在于，所述步驟一中，飛行時間質譜儀閱讀蛋白質芯片的條件設置為：

激光強度：250；

檢測敏感度：9；

分子量優化范圍：1000-50000m/z，最佳聚焦中心為8000m/z；

數據采集參數范圍20～80，收集點數為100次。

9.如權利要求1所述的黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的鑒定方法，其特征在于，

所述步驟一中，利用30只黑斑蛤蚧和30只紅斑蛤蚧提取蛋白質樣品，

提取前，將所述30只黑斑蛤蚧和30只紅斑蛤蚧分成若干組，取每組內蛤蚧的四肢、軀干和尾部的組織，將每組內相同部位的組織混勻后作為一個樣本用來提取蛋白質樣品。