[發明專利]一種快速鑒定驢皮、馬皮和騾子皮的檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201410322626.4
• 申請日: 2014-07-08
• 公開（公告）號: CN104046700A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 張全芳;步迅;劉艷艷
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院生物技術研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種快速鑒定動物物種的方法，特別涉及利用一種分子信標探針(MB)熒光定量PCR檢測法鑒定驢皮、馬皮和騾子皮的檢測方法及試劑盒。

背景技術

阿膠為馬科動物驢的去毛之皮經熬制而成的膠狀物，醫療保健價值極高，具有補血養血、美容養顏、延年益壽、強筋健骨，增強免疫力等五大功能優勢，因此阿膠作為一種保健食品在市場上占有重要的位置，深受消費者的青睞。然而隨著膠類市場的不斷發展，隨著熬膠原料供應的緊張和原料價格上漲，目前一些不法分子在利益的驅使下，用馬皮、騾子皮、牛皮或者豬皮等低廉皮張冒充驢皮現象越來越多，為醫藥保健品市場安全帶來巨大隱患。當前毛皮鑒定方法滯后，國內外動物毛皮的鑒定仍然沒有統一的技術標準或較成熟的鑒別方法，傳統的宏觀觀察法、顯微鏡觀察法具有一定主觀性，無法準確和快速的區分皮張，對于形態相似的馬皮，騾子皮和驢皮則更加難以區分。

近年來隨著分子生物學技術的發展，一些基于DNA的生物學鑒定手段逐漸豐富起來，DNA分子法主要是利用顯示生物特征的各種生物物種所具有的不同DNA序列信息進行鑒別，它可以突破依據動物纖維結構形態的局限性，與傳統分析方法相比，更加具有客觀性和準確性。其中，公開號為CN1605868A的專利所述方法是通過選取細胞色素B基因聚合酶鏈式反應-限制性酶切片段長度多態性方法制備的DNA指紋圖譜來鑒定，但該方法不能對騾子與驢或騾子與馬加以區分。其原因在于：從騾子的遺傳背景分析，母馬與公驢所生的種間雜種叫馬騾，反之母驢配公馬所生的種間雜種叫驢騾。馬騾和驢騾在形態結構、生理特性和生活習性方面的差異，主要有細胞質遺傳和遺傳印記共同作用的結果。馬和驢在正反交中，受精卵的核基因相同。由馬的32條染色體和驢的31條染色體提供；受精卵的質基因不同，馬騾主要由母馬卵細胞的線粒體提供，驢騾主要有母驢卵細胞的線粒體提供。如果是驢騾，同樣有驢的線粒體基因，如果是馬騾就含有馬的線粒體基因，所以僅利用線粒體細胞色素B基因無法同時鑒別馬、驢與騾子。因此，本發明首次將線粒體16SrRNA基因和核基因結合，建立的一種快速鑒別驢皮、馬皮、騾子皮的熒光定量檢測方法對阿膠原料驢皮的快速鑒定具有重要的創新性實踐意義，填補了國內外馬科動物種屬鑒定方法的空白。

發明內容

本發明的目的是提供一種鑒定動物物種的方法，特別涉及一種分子信標探針(MB)熒光定量PCR檢測法鑒定驢皮、馬皮、騾子皮的方法及試劑盒。

為實現上述目的，該試劑盒包括馬和驢共有的一對核基因CKM引物及對應的馬和驢2種核基因特異探針，一對馬和驢線粒體16SrRNA基因的共有引物及對應的2種特異檢測探針，另外還有一組外源性內參體系：包括人工合成一種外源性內參序列并構建的質粒載體作模板，和對應的外源引物及探針，可檢測和避免因樣本含有PCR抑制物而產生的假陰性結果。本發明從馬、驢和騾子的遺傳背景出發，創新性的同時選擇了CKM核基因(nDNA)，以及線粒體基因組DNA(mtDNA)的16SrRNA基因進行分析，設計分子信標探針(MB)特異探針作為鑒定馬、驢和騾子的依據，其理由：一是從騾子的遺傳背景分析，母馬與公驢所生的種間雜種叫馬騾，反之母驢配公馬所生的種間雜種叫驢騾。馬和驢在正反交中，受精卵的核基因相同。由馬的32條染色體和驢的31條染色體提供；受精卵的質基因不同，馬騾主要由母馬卵細胞的線粒體提供，驢騾主要有母驢卵細胞的線粒體提供。因此，可以推斷出：當待測樣本檢出馬、驢的核基因以及驢的線粒體基因時就可以確定為驢騾；當待測樣本檢出馬，驢的核基因以及馬的線粒體基因時即為馬騾；當待測樣本只有馬基因與馬線粒體時，即為馬；當待測樣本既有驢的核基因又有驢線粒體基因時即為驢。二是：本發明根據相關文獻報道克隆得到CKM基因及線粒體mtDNA基因組上的16SrRNA基因，對兩種基因序列分析比對發現在馬與驢物種間基因序列具有穩定性遺傳差異，以此設計馬和驢的特異探針。

分子信標具有高靈敏性，高特異性、相較于TaqMan探針熒光本底低，不僅可以用于基因的定量、定性檢測，還可以應用到基因點突變等分析，基于這些優點，本試劑盒采用分子信標探針(MB)法進行5重五色熒光定量PCR檢測技術，同時能檢測驢、馬、驢騾及馬騾四種成分，而且本試劑盒中加入外源性內參作為內標，可檢測和避免因樣本含有PCR抑制物而產生的假陰性結果。

本試劑盒包括：PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增的驢、馬、驢騾及馬騾的引物混合物，對上述物種進行特異檢測的分子信標探針混合物，以及內標引物，人工構建的內標質粒及探針混合物。