[發(fā)明專利]用于膜蛋白在線鑒定的膜蛋白富集、純化、酶解一體化裝置及使用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410320892.3
• 申請(qǐng)日: 2014-07-08
• 公開（公告）號(hào): CN104076111A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張祥民;劉一穎;晏國全;高明霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/06
• 分類號(hào): G01N30/06
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物分析與檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于膜蛋白共價(jià)固定原理的膜蛋白富集、純化、酶解一體化裝置及其使用方法。?

技術(shù)背景

膜蛋白執(zhí)行著細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換、細(xì)胞識(shí)別與免疫應(yīng)答、信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控，以及能量傳遞等重要功能。因此，膜蛋白的研究已經(jīng)發(fā)展成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的重要部分?；趕hot-gun方法的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合先進(jìn)的生物信息學(xué)分析，為膜蛋白的研究提供了新的手段和辦法。然而，膜蛋白豐度低、疏水性強(qiáng)、水溶性差、且大部分膜蛋白存在糖基化、磷酸化等翻譯后修飾，造成膜蛋白的鑒定難度加大，對(duì)目前通用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。

近年來，膜蛋白的研究主要分為兩個(gè)方向。一是開發(fā)能夠與蛋白酶解、色譜分離和質(zhì)譜鑒定相兼容的膜蛋白增溶劑。美國Waters公司推出了一種酸不穩(wěn)定型表面活性劑RapiGest?SF，它可以增加膜蛋白的溶解能力，而且不抑制蛋白水解酶活性，不過費(fèi)用昂貴，而且酸沉淀過程中會(huì)造成疏水性肽段的損失。二是尋找能夠去除傳統(tǒng)膜蛋白增溶劑（如SDS）的行之有效的方法，以減小其對(duì)后續(xù)鑒定過程的影響。Qian等基于十二烷基磺酸鉀在水溶液中不溶的特點(diǎn)，利用鉀離子沉淀法來去除SDS；Li等利用強(qiáng)陽離子交換柱來分離去除SDS；梁宋平等將膜蛋白固定在膠內(nèi)，然后通過洗滌凝膠的方法來去除SDS，并發(fā)表了一系列工作對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)。目前報(bào)導(dǎo)的這些方法在SDS去除方面效果都不錯(cuò)，但是樣品損失情況嚴(yán)重，重復(fù)性較差，很難推廣應(yīng)用。

基于以上認(rèn)識(shí)，目前膜蛋白組學(xué)的研究真正需要的是一種設(shè)計(jì)新穎，制備便捷，分析快速高效的在線鑒定系統(tǒng)。結(jié)合這一目標(biāo)，我們將膜蛋白固定、增溶劑去除以及酶解三個(gè)步驟集成到一個(gè)10?cm長的反應(yīng)柱內(nèi)，通過一個(gè)六通閥和一個(gè)十通閥的切換實(shí)現(xiàn)了膜蛋白的在線鑒定，大大降低了樣品損失，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種膜蛋白固定效率高、樣品損失率低，結(jié)構(gòu)簡單、操作方便的，用于膜蛋白線鑒定的膜蛋白富集、純化、酶解一體化裝置。?

本發(fā)明提供的用于膜蛋白線鑒定的膜蛋白富集、純化、酶解一體化裝置，由一個(gè)四元高壓泵、一個(gè)進(jìn)樣針、一個(gè)進(jìn)樣環(huán)、一個(gè)六通閥、一個(gè)膜蛋白共價(jià)固定的反應(yīng)柱、一個(gè)十通閥和一個(gè)捕集柱組成；其中，六通閥具有6個(gè)接口，四元高壓泵與六通閥的2號(hào)口相連，六通閥的5號(hào)口為進(jìn)樣口，進(jìn)樣環(huán)連接于六通閥的1號(hào)口和4號(hào)口之間，反應(yīng)柱連接于六通閥的3號(hào)口與十通閥的1號(hào)口之間，捕集柱連接于十通閥的2號(hào)口與6號(hào)口之間，六通閥的5號(hào)口與十通閥的5號(hào)口連接廢液瓶；所述四元高壓泵具有A、B、C、D共4個(gè)相位，分別對(duì)應(yīng)于A、B、C、D?4個(gè)相，A相為反應(yīng)緩沖液，B相為Tris-HCl?和?0NaCl?的混合溶液，C相為NH₄CO₃溶液，D?相為去離子水。如圖1所示。

本發(fā)明中，膜蛋白共價(jià)固定的反應(yīng)柱所用的填料為表面修飾有三氟乙磺酸基、環(huán)氧基或醛基等活性基團(tuán)的球形材料，這些基團(tuán)與膜蛋白表面的游離氨基可發(fā)生親核取代反應(yīng)，從而高效地固定膜蛋白。該親核取代反應(yīng)具有快速高效、非特異性吸附小等優(yōu)點(diǎn)，能夠固定95%以上的膜蛋白。而且，提取膜蛋白時(shí)用到的各種去污劑或表面活性劑以及脂雙層中的磷脂可通過合適的流動(dòng)相洗脫的方法完全去除，不造成實(shí)質(zhì)的樣品損失。隨后再向反應(yīng)柱通入蛋白酶及其緩沖溶液，在線將固定于材料上的膜蛋白充分酶解。進(jìn)一步通過捕集柱富集酶解后的肽段，然后進(jìn)入液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分析。酶解肽段也可通過閥切換直接進(jìn)入LC/MS分析系統(tǒng)，避免樣品在流轉(zhuǎn)中的損失。

本發(fā)明利用六通閥的切換實(shí)現(xiàn)膜蛋白進(jìn)樣、反應(yīng)與酶解；利用十通閥的切換實(shí)現(xiàn)肽段的捕集與液質(zhì)聯(lián)用的分離鑒定。整個(gè)鑒定過程中，膜蛋白無需經(jīng)過離線處理，大大降低了樣品的損失。

?本發(fā)明提供的膜蛋白富集、純化、酶解一體化裝置的使用方法，具體步驟為：

第一步：將六通閥和十通閥均保持在A位，用進(jìn)樣針將膜蛋白樣品注射入進(jìn)樣環(huán)，并利用高壓泵將A相緩沖液沖洗反應(yīng)柱；

第二步：將六通閥切換至B位，用A相將進(jìn)樣環(huán)中的樣品以0.1-0.4μL/min的流速通過反應(yīng)柱；

第三步，將六通閥切換至A位，先后用B相和C相沖洗反應(yīng)柱，并在進(jìn)樣環(huán)中注射Trypsin溶液；

第四步，將六通閥切和十通閥均換至B位，用C相將酶溶液以0.1-0.4μL/min的流速通過反應(yīng)柱，然后用D相沖洗反應(yīng)柱以及捕集柱；

第五步：將十通閥切換至C位，利用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)捕集柱內(nèi)的肽段進(jìn)行分析（如圖2）。