[發明專利]一種快速鑒別1型和3型鴨甲肝病毒的雙重熒光定量方法

在審

• 申請號: 201410317515.4
• 申請日: 2014-07-04
• 公開（公告）號: CN104046704A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 姜世金;林少莉;張瑞華
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測1型和3型鴨甲肝病毒的雙重熒光定量RT-PCR特異性引物，其特征在于是對GenBank上已發表的DHAV-1、DHAV-3的序列進行比對，在兩種病毒基因序列的保守但相互之間差異又較大的區域，分別設計一對針對DHAV-1的特異性檢測引物SEQ1和SEQ2，一條Taqman探針Probe1；一對針對DHAV-3的特異性檢測引物SEQ3和SEQ4，一條Taqman探針Probe2，引物序列如下：

SEQ1：5’-AGACACATGTTGCTGAAAAACT-3’，

SEQ2：5’-AGAACCAGTTGTCGTTTGGTC-3’，

SEQ3：5’-CTTGAACGTAATAGAGCTTGG-3’，

SEQ4：5’-AAAGTCTTTTGGTAGAGTCTTAGC-3’，

Probe1:5’CY5-ATGCCATGACACTATCTCATATGAGTCAGC-3’BHQ2,

Probe2：5’FAM-ACACTTGGCACCATTGTGTCCCTCATAAC-3’TAMRA，

所有引物以無菌ddH₂O配成10pmol/μl的濃度備用；

上述引物、探針的使用方法為：

A、常規方法提取待測鴨肝組織總RNA作為模板，進行反轉錄反應；反應體系為：模板RNA4μl，SEQ2/SEQ4引物各0.5μl，5×M-MLV?Buffer2μl，濃度為10.0mM的dNTPs2μl，Rnase?Inhibition0.25μl，濃度為5U/μl的RTase?M-MLV0.5μl，ddH2O0.75μl；反應程序為：42℃反應50min，70℃15min，獲得病毒cDNA；

B、以病毒cDNA為模板進行熒光定量RT-PCR反應；反應體系為：3.45μL?ddH₂O，12.5μL?Premix?Ex?Taq，SEQ1、SEQ2、SEQ3和SEQ4各1μl，ROX?Reference?Dye?II0.25μl,Probe10.5μl和Probe20.3μl，2μl?cDNA模板；

PCR反應條件為：95℃5min；95℃15s，60℃45s，40個循環；于60℃時收集熒光；

C、用標準曲線計算出測得Ct值所對應的樣品濃度：反應最終輸出的Ct值可用標準曲線換算出對應的樣品濃度，縱坐標為所得Ct值，橫坐標為樣品濃度的對數值。