[發明專利]一種定位定量檢測DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法

有效

• 申請號: 201410316151.8
• 申請日: 2014-07-04
• 公開（公告）號: CN104032030A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 周翔;王少儒;田沺;王佳琪;翁小成
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

1.一種定位定量檢測DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）進行DNA復制反應：向含有2~10?mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10~50?mM的硫酸銨、1~10?mM的氯化鉀、20~100?mM的硫酸鎂和20~100?mM的聚乙二醇辛基苯基醚的緩沖溶液中加入DNA聚合酶、引物、三磷酸脫氧核糖核苷酸和DNA模板鏈，形成DNA復制反應體系，其中，DNA復制反應體系中各物質的濃度：DNA聚合酶為0.2~0.5?U，引物為200~500?nM，三磷酸脫氧核糖核苷酸為100?~?400?μM，DNA模板鏈為0.3?~?3?mM；DNA復制反應體系在50~70℃中延伸反應20~60?min；

2）進行RNA逆轉錄反應：向含有2~10?mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10~50?mM的硫酸銨、1~10?mM的氯化鉀、20~100?mM的硫酸鎂和20~100?mM的聚乙二醇辛基苯基醚的緩沖溶液中加入RNA聚合酶、引物、三磷酸核糖核苷酸、RNA酶抑制劑和RNA模板鏈，形成RNA逆轉錄反應體系，其中，RNA逆轉錄反應體系中各物質的濃度：RNA聚合酶為0.2~0.5?U，引物為200~500?nM、三磷酸核糖核苷酸為100?~?400?μM，?RNA酶抑制劑為0.2~0.5?U，?RNA模板鏈為0.2~3?mM；其中，RNA聚合酶和RNA酶抑制劑濃度比為1:1；RNA逆轉錄反應體系在50~70^oC中延伸反應20~60?min；

3）定位定量檢測6-甲基氨基嘌呤：向步驟1）的DNA復制反應體系和步驟2）的RNA逆轉錄反應體系中加入猝滅劑使延伸反應終止，然后在80~100?^oC孵育10~30?min，冷卻至室溫，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以檢測出DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的數量；根據引物鏈和其延伸鏈的相對位置，可以確定DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的特定位點。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的DNA模板鏈為不含6-甲基氨基嘌呤的DNA和含6-甲基氨基嘌呤的DNA。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的RNA模板鏈為不含6-甲基氨基嘌呤的RNA和含6-甲基氨基嘌呤的RNA。

4.根據權利要求1~3任意一項所述的方法，其特征在于：所述的三磷酸脫氧核糖核苷酸為脫氧胸苷三磷酸、三磷酸脫氧尿苷、5-羥甲基脫氧尿三磷酸或5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述的DNA聚合酶為牛生長激素聚合酶時，DNA復制反應體系中加入耐熱聚合酶反應緩沖液和聚乙二醇辛基苯基醚，DNA復制反應體系中耐熱聚合酶反應緩沖液的體積分數為50%、聚乙二醇辛基苯基醚的濃度為1wt%。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述的DNA聚合酶為克列諾片段聚合酶時，DNA復制反應體系中加入雙酶切緩沖液和2.5倍緩沖溶液體積的二硫蘇糖醇，DNA復制反應體系中雙酶切緩沖液的體積分數為50%。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述的猝滅劑中甲酰胺的體積分數為80%、乙二胺四乙酸二鈉的濃度為200?mM，猝滅劑的pH值為8.0。

8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述的聚丙烯酰胺凝膠為體積分數為12%~20%的變性聚丙烯酰胺凝膠。