[發(fā)明專利]黃曲霉毒素B1的實時定量PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410315905.8
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104818319B
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭楠;郭曉東;文芳;王海微;汪慧;李松勵;王加啟
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京思元知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11598
• 代理人: 余光軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種黃曲霉毒素B₁的檢測方法，尤其涉及一種基于適配體的生物傳感器結(jié)合實時定量PCR的黃曲霉毒素B₁的檢測方法，屬于黃曲霉毒素B₁的定量檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

黃曲霉毒素是最重要的霉菌毒素之一，是由包括黃曲霉和寄生曲霉的霉菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，在黃曲霉毒素的幾種亞型中(B₁,B₂,G₁,G₂和M₁)，AFB₁的毒性最強，因此AFB₁被世界衛(wèi)生組織(WHO)國際癌癥研究機構(gòu)指定為主要致癌物。由于霉菌毒素對動物和人類產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，霉菌毒素污染在飼料和食品安全領(lǐng)域已經(jīng)引起了全球的廣泛關(guān)注。

AFB₁可以直接污染食品(例如在高溫潮濕環(huán)境下谷類，堅果)或者間接污染飼料，動物采食AFB₁后，在奶中產(chǎn)生代謝物。為了阻止由于污染的飼料和食品的召回帶來的食品安全恐慌和經(jīng)濟損失，很多國家對黃曲霉毒素進(jìn)行了限量。不同食品AFB₁的限量范圍為0.05-20ng mL^-1。對于AFB₁低限量，高出現(xiàn)率和其劇毒性表明快速，靈敏和特異性檢測方法甚至定量追蹤AFB₁的水平是十分必要的。

現(xiàn)有的定量檢測AFB₁的方法主要有TLC、HPLC和LC結(jié)合MS技術(shù)。然而，儀器法需要復(fù)雜的前處理，專業(yè)的操作人員和昂貴的儀器設(shè)備，這些要求限制了儀器法的應(yīng)用。因此，一些快速篩選方法如ELISA，免疫傳感器和SPR的方法也得到了廣泛的應(yīng)用。但是在運輸和貯存過程中由于抗體的穩(wěn)定性難以保證，尤其是在受控環(huán)境中時，限制了這類方法的應(yīng)用。與抗體有著類似功能的適配體，具有低價格，高穩(wěn)定性，易修飾和易合成等優(yōu)點，可以重復(fù)使用和長時間保存。除此之外，適配體可以作為PCR擴增的模板很大 程度上提高檢測靈敏度，產(chǎn)生的熒光信號作為定量檢測的指示器。但是，基于適配體傳感器的霉菌毒素研究主要集中于OTA和FB₁，可用于霉菌毒素的適配體是十分有限的，有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于適配體的生物傳感器的黃曲霉毒素B₁的實時定量PCR檢測方法，該檢測方法具有線性范圍好、靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性強等優(yōu)點。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種檢測黃曲霉毒素B₁的實時定量PCR檢測方法，該方法包括以下步驟：

本發(fā)明公開了一種黃曲霉毒素B₁(AFB₁)的實時定量PCR檢測方法，該方法利用黃曲霉毒素B₁適配體對黃曲霉毒素B₁進(jìn)行識別，利用實時定量PCR對黃曲霉毒素B₁適配體的互補DNA鏈進(jìn)行擴增作為信號輸出，從而實現(xiàn)對黃曲霉毒素B₁的識別和檢測，所述實時定量PCR檢測方法包括以下步驟：

(1)將AFB₁的生物素化的適配體與互補單鏈DNA鏈進(jìn)行雜交，得到混合溶液；(2)將混合溶液加入到PCR管中；(3)將待檢測的樣品加入到PCR管中；與適配體雜交的互補單鏈DNA鏈與待檢測的樣品中的AFB₁相結(jié)合，釋放出互補單鏈DNA鏈；去除PCR管中適配體與黃曲霉毒素B₁的復(fù)合物以及釋放出的互補DNA鏈；(4)向PCR管中加入特異性的上下游引物，以固定在PCR管表面的互補單鏈DNA為模板建立RT-qPCR定量檢測體系，進(jìn)行RT-qPCR擴增反應(yīng)；(4)根據(jù)擴增結(jié)果，建立黃曲霉毒素B₁與擴增循環(huán)數(shù)(Ct值)之間的線性關(guān)系，對黃曲霉毒素B₁的含量進(jìn)行定量分析。

本發(fā)明中所述的“AFB₁的生物素化的適配體”的核苷酸序列優(yōu)選為 SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，在其3′端連有生物素。

本發(fā)明中所述的“互補單鏈DNA鏈”的核苷酸序列可以是任何一種能夠與SEQ ID No.1所示的核苷酸序列進(jìn)行互補或雜交的序列；本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列很容易設(shè)計得到，優(yōu)選為SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。