[發明專利]黃曲霉毒素B1的實時定量PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201410315905.8
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104818319B
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發明（設計）人: 鄭楠;郭曉東;文芳;王海微;汪慧;李松勵;王加啟
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙)11598
• 代理人: 余光軍

1.黃曲霉毒素B₁的實時定量PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)將AFB₁的生物素化的適配體與互補單鏈DNA鏈進行雜交，得到混合溶液；(2)將混合溶液加入到吸附或交聯有鏈霉親和素的PCR管中；(3)將待檢測的樣品加入到PCR管中，釋放出互補單鏈DNA鏈；(4)用固定在PCR管表面的互補單鏈DNA建立RT-qPCR定量檢測體系進行RT-qPCR擴增反應；(4)根據擴增結果，對樣品中AFB₁的含量進行定量分析；

其中，所述的AFB₁的生物素化的適配體的核苷酸序列為SEQ ID No.1所示，其3′端連有生物素；

所述的互補單鏈DNA的核苷酸序列為SEQ ID No.2所示；

步驟(2)所述鏈霉親和素的濃度為2.5ng mL^-1；

步驟(1)所述生物素化的適配體濃度為5.0nM；

步驟(1)將AFB₁的生物素化的適配體與互補單鏈DNA鏈按照1:1的體積比進行雜交；

步驟(4)RT-qPCR定量檢測體系中互補單鏈DNA濃度范圍為1×10^-4到10nM；

步驟(4)中所述的RT-qPCR定量檢測體系按照以下方式建立：50μL PCR反應體系由以下部分組成：濃度范圍1×10^-4到10nM之間的互補單鏈DNA為5μL，10μM上、下游引物分別添加2μL，25μLPremix Ex1μL 50×ROX Reference Dye II和15μL水；所述上、下游引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

所述的RT-qPCR反應參數如下：預變性30s 95℃,變性40個循環5s 95℃,退火34s 60℃。

2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：根據擴增結果，建立黃曲霉毒素B₁與擴增循環數之間的線性關系，對黃曲霉毒素B₁的含量進行定量分析。

3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于：所述線性關系的線性回歸方程為：Ct＝3.816lg C+24.622，其中，Ct表示循環數，C表示AFB₁的濃度。