[發明專利]用于檢測牛CWC15基因隱性致死突變的引物及試劑盒

有效

• 申請號: 201410311877.2
• 申請日: 2014-07-02
• 公開（公告）號: CN104131084A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 張毅;郭剛;劉林;石萬海;李錫智;張勝利
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及家畜遺傳缺陷的分子診斷技術，具體地說，涉及一種用于檢測牛CWC15基因隱性致死突變的特異性引物及試劑盒。?

背景技術

娟珊牛是一個著名的小型乳用牛品種，具有乳成分高、耐熱性好、綜合效益高等優點。近年來，我國一些大型奶業企業，陸續進口娟珊牛，豐富現有奶牛品種資源，生產特色牛奶。然而，由于娟珊牛在世界范圍內都是一個小品種，種質來源較為狹窄，群體近交程度普遍較高。據報道，美國1990年之后出生的荷斯坦牛平均近交系數為6.0％，娟珊牛為8.2％(VanRaden等，2011)；在加拿大，2000–2007出生的荷斯坦牛平均近交系數為8％，但娟姍牛達到14％(Stachowicz等，2011)。隨著近交程度的增加，群體內遺傳缺陷基因快速擴散的風險也隨之增大。?

2011年，美國農業部家畜遺傳改良實驗室的科學家VanRaden等首先發現在娟珊牛中存在一種隱性致死遺傳缺陷單倍型(JH1)，該單倍型純合后，導致母牛因胚胎早期死亡而流產，攜帶該遺傳缺陷的種公牛的配種妊娠率降低3.7％(VanRaden等，2011)。之后，Sonstegard等(2013)確定其分子機理為，牛15號染色體的CWC15基因編碼區內的C→T突變，導致編碼氨基酸從精氨酸突變為終止密碼，造成其蛋白產物由原來的231個氨基酸減少到54個氨基酸。因CWC15基因在mRNA剪接中具有重要功能，故該突變最終導致胚胎發育早期死亡。系譜追溯發現，JH1致死單倍型最早可以追溯到1962年出生的美國公牛Observer?Chocolate?Soldier(Sonstegard等，2013)。該公牛家系在美國的娟珊牛群體中具有重要影響，據統計，過去30多年里，美國娟珊?牛JH1攜帶率始終高達20～25％(Sonstegard等，2013)。隨著遺傳物質在世界范圍內的交流，該遺傳缺陷基因很可能已擴散到世界各國娟珊牛群中。因此，亟需建立對該遺傳缺陷基因的分子檢測技術，從而對當前的娟珊牛群進行全面篩查，為今后實施科學的繁育管理提供技術手段。?

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測牛CWC15基因隱性致死突變的特異性引物及試劑盒。?

為了實現本發明目的，本發明首先提供用于檢測牛CWC15基因隱性致死突變的特異性引物，包括：上游引物CWC15F15’-GGGACTGAGGATGAAGTTGC-3’和下游引物CWC15R15’-GGTTGGGAATACGGAAAGGT-3’。?

本發明還提供含有上述引物的用于檢測牛CWC15基因隱性致死突變的試劑盒。?

優選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液、內切酶TaqαⅠ、酶切緩沖液中的一種或多種。?

更優選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。?

本發明進一步提供所述引物或試劑盒在檢測牛CWC15基因隱性致死突變中的應用，包括以下步驟：?

1)提取待測牛的基因組DNA；?

2)以待測牛的基因組DNA為模板，利用所述引物CWC15F1和CWC15R1，進行PCR擴增；?

3)采用RFLP法檢測PCR擴增產物。?

利用上述引物可擴增出包含隱性致死突變位點的CWC15基因片段，長度為1246bp。該片段的野生型等位基因包含2個TaqαⅠ酶切位點(圖2)，將1246bp的片段切為3個片段，即(129bp、402bp和715bp)；突變型等位基因，由于C→T突變，導致第1個酶切位點消失，從而只?產生2個條帶(402bp和844bp)。因此通過觀察酶切產物是否存在844bp條帶，即可確定隱性有害基因的攜帶者。牛CWC15基因隱性有害突變攜帶者部分測序結果如圖1所示。?

步驟2)中PCR反應使用的擴增體系以25μl計為：10×PCR反應緩沖液2.5μL，Taq?DNA聚合酶0.75U，Mg²⁺2mM，dNTP200μM，上、下游引物各20pmol，基因組DNA模板20-50ng，用ddH₂O補齊至總體積25μl。?

步驟2)中PCR反應使用的擴增程序為：95℃預變性8min；然后進行35個循環：95℃變性30s，60℃復性30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。?